Wie man Plasmid-DNA während der Extraktion von chromosomaler DNA unterscheidet?

Plasmid-DNA-Extraktion ist eine grundlegende und wichtige Technik in der molekularbiologischen Forschung. Der Schlüssel zur Unterscheidung von Plasmid-DNA und chromosomaler DNA liegt in ihren unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Hier sind einige gängige Methoden zur Differenzierung.

1. Alkalische Lyse

Die alkalische Lyse ist eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Plasmid-DNA-Extraktion. Sein Prinzip basiert auf den Unterschieden in der topologischen Struktur zwischen chromosomaler DNA und Plasmid-DNA. Die bakterielle Zellwand und Zellmembran werden in einer stark alkalischen Umgebung zerstört, Freisetzung chromosomaler DNA und Plasmid-DNA. Die lineare DNA-Doppelhelixstruktur wird zerstört und denaturiert, während kovalent geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA, obwohl unter starkem Alkali denaturiert(pH-Wert 12.6) Bedingungen, Es gibt immer noch zwei komplementäre Stränge, die miteinander verflochten und eng verbunden sind. Bei einem pH-Wert von 4,8 wird Kaliumacetat verwendet(oder Natriumacetat) Zur Wiederherstellung der Neutralität wird eine salzreiche Pufferlösung zugesetzt, Kovalent geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA renaturiert schnell, während lineare chromosomale DNA langsam renaturiert. Bakterielle Proteine, Aufgebrochene Zellwände, und denaturierte chromosomale DNA wird sich zu großen Komplexen verwickeln, die von Natriumdodecylsulfat bedeckt sind(Sicherheitsdatenblatt). Plasmid-DNA kann aus dem Überstand nach Zentrifugation zur Entfernung des Denaturierungsmittels gewonnen werden.

2. Kochende Lyse

Die Siedelyse eignet sich besonders für kleine Plasmide von weniger als 15 kb. Bei dieser Methode werden Bakterien in einem Puffer suspendiert, der Triton X-100 und Lysozym enthält, das die Zellwand verdauen kann, dann Erhitzen auf 100°C, um eine Lyse zu bewirken. Erhitzen zerstört nicht nur die Zellwand, sondern trägt auch dazu bei, die DNA-Strang-Basenpaarung zu entwirren und Proteine ​​sowie chromosomale DNA zu denaturieren. Geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA trennt sich nicht voneinander, da ihre Phosphodiester-Rückgrate in einer topologischen Struktur miteinander verflochten sind. Wenn die Temperatur sinkt, Die Basen der geschlossenen zirkulären DNA kehren an ihre Positionen zurück, Es entsteht ein superspiralisiertes Molekül. Plasmid-DNA kann nach Zentrifugation aus dem Überstand gewonnen werden, um denaturierte chromosomale Nukleoproteine ​​zu entfernen.

3. Mini-Prep-Extraktion in einem Schritt

Die einstufige Mini-Prep-Extraktion basiert auf der Tatsache, dass bakterielle chromosomale DNA viel größer ist als Plasmid-DNA. Bakterielle chromosomale DNA wird in lineare Fragmente unterschiedlicher Größe zerschnitten, die an Zelltrümmern haften und unter mechanischer Kraft denaturieren. Allerdings wird auch Plasmid-DNA denaturiert, es renaturiert schnell, nachdem die mechanische Kraft verschwunden ist, in der Lösung löslich bleiben, während die bakterielle chromosomale DNA langsam renaturiert, Es bildet sich eine unlösliche Netzstruktur. Plasmid-DNA kann durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation getrennt werden.

4. Anwendung von Reinigungssäulen

Reinigungssäulen bestehen im Allgemeinen aus einer Schicht einer Silikonmembran,  die DNA selektiv adsorbieren kann, und dieser Prozess ist reversibel. Die Silanolgruppen auf der Oberfläche der Silikonmembran werden nach der Dissoziation in der Lösung negativ geladen, Es bildet eine elektrische Brücke mit positiv geladenen Salzionen und negativ geladener DNA, Dadurch wird DNA adsorbiert. Die Silikonmembran adsorbiert selektiv DNA unter Bedingungen mit hohem Salzgehalt und niedrigem pH-Wert, und die Silikonmembran setzt DNA unter Bedingungen mit niedrigem Salzgehalt und hohem pH-Wert frei, .

5. Nukleinsäureextraktion durch Magnetkügelchen-Methode

DNA-Moleküle binden an die positiv geladenen Moleküle (wie positiv geladene chemische Gruppen) auf der Oberfläche von magnetische Perlen durch ihre negativ geladenen Phosphatrückgrate über elektrostatische Bindung bei spezifischem pH-Wert, Salzkonzentration, und Temperatur. Diese Bindung ist spezifisch, Dadurch wird sichergestellt, dass nur die Ziel-DNA-Moleküle an die Magnetkügelchen binden. In einigen Fällen, wie zum Beispiel wann PFLOCK (Polyethylenglykol) und Salzionen werden hinzugefügt, Die Konformation von DNA-Molekülen unterliegt drastischen Veränderungen. Der lineare Zustand wird in einen gekräuselten kugelförmigen Zustand komprimiert, Dadurch lässt sich DNA leichter mit Magnetkügelchen binden. Gleichzeitig, Unter Einwirkung von PEG und Salzionen werden DNA-Moleküle unterschiedlicher Länge selektiv ausgefällt, Dadurch wird die Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe erreicht.

Duale Magnetperlenmethode: Hierbei handelt es sich um eine Technologie, die auf dem Prinzip der Plasmidextraktion basiert, Verwendung von zwei Arten von Magnetperlen mit unterschiedlichen Funktionen. Magnetkügelchen I werden zur Entfernung von Bakterienresten nach der Lyse verwendet, während Magnetbead II zur spezifischen Trennung von Nukleinsäuremolekülen verwendet wird. Unter der Wirkung von Lysepuffer, SDS verbindet sich mit Bakterientrümmern, Proteine, und andere Verunreinigungen, um ein unlösliches Kalium zu bilden (oder Natrium) Salzniederschlagskomplex, das aufgrund der Kombination einer großen Menge K eine positive Ladung aufweist⁺ (oder Na⁺). Magnetperle I, mit einer großen Anzahl negativ geladener Polycarboxylat-Magnetkügelchen, kann Verunreinigungen durch elektrostatische Adsorption und Koordination mit dem positiv geladenen K gezielt adsorbieren⁺ (oder Na⁺) Komplex. Die Oberfläche des Magnetkügelchens II ist mit zahlreichen Silanolgruppen modifiziert, das Nukleinsäuren in einer alkoholischen Lösungsmittelumgebung spezifisch adsorbieren kann, basiert auf diesem Prinzip, die spezifische Trennung von Plasmid-DNA erreicht werden.

Mit den oben genannten Methoden kann Plasmid-DNA effektiv von den Wirtszellen getrennt und ihre Reinheit und Integrität sichergestellt werden, eine solide Grundlage für nachfolgende molekularbiologische Experimente legen.

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Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.wurde gegründet in 2016 Das ist ein professioneller Hersteller von biomagnetischen Materialien und Nukleinsäure-Extraktionsreagenzien.

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