Sådan skelnes plasmid-DNA fra kromosomalt DNA under ekstraktion?

Plasmid DNA-ekstraktion er en grundlæggende og vigtig teknik inden for molekylærbiologisk forskning. Nøglen til at skelne plasmid-DNA fra kromosomalt DNA ligger i deres forskelle i fysiske og kemiske egenskaber. Her er flere almindelige metoder til differentiering.

1. Alkalisk lyse

Den alkaliske lysis er en af ​​de mest udbredte metoder til plasmid-DNA-ekstraktion. Dens princip er baseret på forskellene i topologisk struktur mellem kromosomalt DNA og plasmid-DNA. Bakteriens cellevæg og cellemembran er forstyrret i et stærkt alkalisk miljø, frigivelse af kromosomalt DNA og plasmid-DNA. Lineær DNA-dobbelthelixstruktur ødelægges og denatureres, mens det er kovalent lukket cirkulært plasmid-DNA, skønt denatureret under stærkt alkalisk(pH 12.6) forhold, har stadig to komplementære tråde, der er sammenflettet og tæt forbundet. Når pH 4,8 acetat kalium(eller natriumacetat) bufferopløsning med højt saltindhold tilsættes for at genoprette neutraliteten, kovalent lukket cirkulært plasmid DNA renatureres hurtigt, mens lineært kromosomalt DNA renatureres langsomt. Bakterielle proteiner, sprængte cellevægge, og denatureret kromosomalt DNA vil vikle sig ind i store komplekser, som er dækket af natriumdodecylsulfat(SDS). Plasmid-DNA kan udvindes fra supernatanten efter centrifugering for at fjerne denaturanten.

2. Kogende Lysis

Kogende lysis er særligt velegnet til små plasmider på mindre end 15 kb. Denne metode involverer suspendering af bakterier i en buffer indeholdende Triton X-100 og lysozym, der kan fordøje cellevæggen, derefter opvarmning til 100°C for at forårsage lysis. Opvarmning ødelægger ikke kun cellevæggen, men hjælper også med at udvikle DNA-strengs baseparring og denaturere proteiner og kromosomalt DNA. Lukket cirkulært plasmid-DNA adskiller sig ikke fra hinanden, fordi deres phosphodiester-rygrad er sammenflettet i en topologisk struktur. Når temperaturen falder, baserne i det lukkede cirkulære DNA vender tilbage til deres positioner, danner et supersnoet molekyle. Plasmid-DNA kan genvindes fra supernatanten efter centrifugering for at fjerne denaturerede kromosomale nukleoproteiner.

3. Mini-Prep One-Step Extraction

Mini-prep et-trins ekstraktionen er baseret på det faktum, at bakterielt kromosomalt DNA er meget større end plasmid DNA. Bakterielt kromosomalt DNA skæres i forskellige størrelser af lineære fragmenter, der klæber til celleaffald og bliver denatureret under mekanisk kraft. Selvom plasmid-DNA også er denatureret, det renatureres hurtigt, efter at den mekaniske kraft forsvinder, forbliver opløseligt i opløsningen, mens bakterielt kromosomalt DNA renatureres langsomt, danner en uopløselig retikulær struktur. Plasmid-DNA kan adskilles ved højhastighedscentrifugering.

4. Anvendelse af rensesøjler

Rensningssøjler er generelt sammensat af et lag af silikonemembran,  som selektivt kan adsorbere DNA, og denne proces er reversibel. Silanolgrupperne på overfladen af ​​silikonemembranen bliver negativt ladede efter dissociation i opløsningen, danner en elektrisk bro med positivt ladede saltioner og negativt ladet DNA, derved adsorbere DNA. Silikonemembranen adsorberer selektivt DNA under betingelser med højt salt og lavt pH, og silikonemembranen frigiver DNA under lav-salt høj-pH betingelser, .

5. Nukleinsyreekstraktion ved magnetisk perlemetode

DNA-molekyler binder sig til de positivt ladede molekyler (såsom positivt ladede kemiske grupper) på overfladen af magnetiske perler gennem deres negativt ladede fosfatskeletter via elektrostatisk binding ved specifik pH, saltkoncentration, og temperatur. Denne binding er specifik, sikre, at kun mål-DNA-molekylerne binder til de magnetiske perler. I nogle tilfælde, fx hvornår PEG (polyethylenglycol) og saltioner tilsættes, DNA-molekylernes konformation undergår drastiske ændringer. Den lineære tilstand komprimeres til en krøllet sfærisk tilstand, hvilket gør DNA lettere at binde med magnetiske perler. På samme tid, DNA-molekyler af forskellig længde gennemgår selektiv udfældning under påvirkning af PEG og saltioner, således opnås adskillelse af DNA-fragmenter af forskellig størrelse.

Dobbelt magnetisk perlemetode: Dette er en teknologi udviklet baseret på princippet om plasmidekstraktion, ved hjælp af to typer magnetiske perler med forskellige funktioner. Magnetisk perle I bruges til at fjerne bakterierester efter lysis, mens magnetisk perle II bruges til den specifikke adskillelse af nukleinsyremolekyler. Under påvirkning af lysisbuffer, SDS kombineres med bakterieaffald, proteiner, og andre urenheder for at danne et uopløseligt kalium (eller natrium) saltpræcipitatkompleks, som har en positiv ladning på grund af kombinationen af ​​en stor mængde K⁺ (eller Na⁺). Magnetisk perle I, med et stort antal negativt ladede polycarboxylatmagnetiske perler, kan specifikt adsorbere urenheder gennem elektrostatisk adsorption og koordinering med det positivt ladede K⁺ (eller Na⁺) kompleks. Magnetisk perle II har en overflade modificeret med rigelige silanolgrupper, som specifikt kan adsorbere nukleinsyrer i et alkoholopløsningsmiddelmiljø, baseret på dette princip, den specifikke adskillelse af plasmid-DNA kan opnås.

Plasmid-DNA kan effektivt adskilles fra værtscellerne, og dets renhed og integritet kan sikres ved ovenstående metoder, lægger et solidt fundament for efterfølgende molekylærbiologiske eksperimenter.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.blev etableret i 2016 som er en professionel producent af biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraktionsreagenser.

Vi har stor erfaring med udvinding og oprensning af nukleinsyre, proteinoprensning, celleadskillelse, kemiluminescens og andre tekniske områder.

Vores produkter er meget udbredt inden for mange områder, såsom medicinsk test, genetisk testning, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke kun produkter, men kan også påtage os OEM, ODM, og andre behov.Hvis du har et relateret behov, er du velkommen til at kontakte os påsales01@lingjunbio.com.