抽出中にプラスミド DNA と染色体 DNA を区別する方法?

プラスミドDNAの抽出 分子生物学研究における基本的かつ重要な技術です. プラスミド DNA と染色体 DNA を区別する鍵は、物理的および化学的特性の違いにあります。. 差別化のための一般的な方法をいくつか紹介します。.

1. アルカリ溶解

アルカリ溶解は、プラスミド DNA 抽出に最も広く使用されている方法の 1 つです。. その原理は、染色体 DNA とプラスミド DNA のトポロジー構造の違いに基づいています。. 強アルカリ環境下では細菌の細胞壁や細胞膜が破壊される, 染色体DNAとプラスミドDNAの放出. 直鎖状DNA二重らせん構造が破壊され変性する, 一方、共有結合で閉じた環状プラスミド DNA, 強アルカリで変性しますが、(pH 12.6) 条件, 絡み合って密接に関連している2つの相補鎖がまだ残っています. pH4.8の場合酢酸カリウム(または酢酸ナトリウム) 中性を回復するために高塩濃度の緩衝液を加えます。, 共有結合で閉じた環状プラスミド DNA はすぐに復元します, 一方、直鎖状の染色体 DNA はゆっくりと再生します。. 細菌タンパク質, 壊れた細胞壁, 変性した染色体 DNA は絡み合って大きな複合体を形成します, ドデシル硫酸ナトリウムでカバーされています(SDS). 変性剤を除去するために遠心分離した後、上清からプラスミド DNA を回収できます。.

2. 沸騰溶解

沸騰溶解は、以下の小さなプラスミドに特に適しています。 15 kb. この方法では、細胞壁を消化できる Triton X-100 とリゾチームを含む緩衝液に細菌を懸濁します。, 次に100℃に加熱して溶解を引き起こします. 加熱は細胞壁を破壊するだけでなく、DNA鎖の塩基対をほどき、タンパク質や染色体DNAを変性させるのにも役立ちます。. Closed circular plasmid DNA does not separate from each other because their phosphodiester backbones are intertwined in a topological structure. When the temperature drops, the bases of the closed circular DNA return to their positions, forming a supercoiled molecule. Plasmid DNA can be recovered from the supernatant after centrifugation to remove denatured chromosomal nucleoproteins.

3. Mini-Prep One-Step Extraction

The mini-prep one-step extraction is based on the fact that bacterial chromosomal DNA is much larger than plasmid DNA. Bacterial chromosomal DNA is sheared into different sizes of linear fragments that adhere to cell debris and become denatured under mechanical force. Although plasmid DNA also is denatured, it renatures quickly after the mechanical force disappears, remaining soluble in the solution, 一方、細菌の染色体 DNA はゆっくりと再生します。, 不溶性の網状構造を形成する. 高速遠心分離によりプラスミドDNAを分離可能.

4. 精製カラムの応用

精製カラムは通常、シリコン膜の層で構成されています。,  DNAを選択的に吸着できる, そしてこのプロセスは可逆的です. シリコーン膜表面のシラノール基は溶液中で解離するとマイナスに帯電します。, 正に帯電した塩イオンと負に帯電したDNAで電気橋を形成する, それによってDNAを吸着する. シリコーン膜は高塩分、低 pH 条件下で DNA を選択的に吸着します。, シリコン膜は低塩分、高 pH 条件下で DNA を放出します。, .

5. 磁気ビーズ法による核酸抽出

DNA分子は正に帯電した分子に結合します (正に帯電した化学基など) の表面に 磁気ビーズ 特定の pH での静電結合を介して、負に帯電したリン酸骨格を介して, 塩分濃度, と温度. このバインディングは特殊です, ターゲット DNA 分子のみが磁気ビーズに結合することを保証します。. 場合によっては, いつのような ペグ (ポリエチレングリコール) そして塩イオンが加えられる, DNA分子の構造が大きく変化する. 直線状態を圧縮して丸まった球状状態にする, これにより、DNA が磁性ビーズと結合しやすくなります。. 同時に, 異なる長さの DNA 分子は、PEG と塩イオンの作用下で選択的に沈殿します。, これにより、異なるサイズの DNA 断片を分離することができます。.

デュアル磁気ビーズ法: プラスミド抽出の原理に基づいて開発された技術です。, 機能の異なる2種類の磁気ビーズを使用. 磁気ビーズ I は、溶解後に細菌の破片を除去するために使用されます。, 一方、磁気ビーズ II は核酸分子の特異的分離に使用されます。. 溶解バッファーの作用下, SDS は細菌の破片と結合します, タンパク質, 不溶性カリウムを形成する他の不純物 (またはナトリウム) 塩沈殿複合体, Kが多量に結合しているため、プラスの電荷を帯びています。⁺ (またはナ⁺). 磁気ビーズI, 負に帯電したポリカルボキシレート磁気ビーズを多数使用, 正に帯電したKとの静電吸着と配位により不純物を特異的に吸着します。⁺ (またはナ⁺) 複雑な. 豊富なシラノール基で表面修飾された磁性ビーズII, アルコール溶媒環境下で核酸を特異的に吸着できる, この原則に基づいて, プラスミド DNA の特異的な分離を達成できます。.

上記の方法により、プラスミド DNA を宿主細胞から効果的に分離でき、その純度と完全性を保証できます。, その後の分子生物学実験のための強固な基盤を築く.

サプライヤー

上海霊軍生物技術有限公司, 株式会社に設立されました 2016 生体磁性材料と核酸抽出試薬の専門メーカーです.

核酸抽出・精製の経験が豊富です。, タンパク質の精製, 細胞分離, 化学発光およびその他の技術分野.

当社の製品はさまざまな分野で広く使用されています, 医療検査など, 遺伝子検査, 大学の研究, 遺伝子育種, 等々. 製品のご提供だけでなくOEMも承ります, ODM, 関連するニーズがある場合, お気軽にお問い合わせください。sales01@lingjunbio.com.