Como distinguir o DNA plasmidial do DNA cromossômico durante a extração?

Extração de DNA plasmidial é uma técnica fundamental e importante na pesquisa de biologia molecular. A chave para distinguir o DNA plasmídico do DNA cromossômico reside em suas diferenças nas propriedades físicas e químicas. Aqui estão vários métodos comuns de diferenciação.

1. Lise Alcalina

A lise alcalina é um dos métodos mais utilizados para extração de DNA plasmidial. Seu princípio é baseado nas diferenças na estrutura topológica entre o DNA cromossômico e o DNA plasmidial. A parede celular bacteriana e a membrana celular são rompidas em um ambiente alcalino forte, liberando DNA cromossômico e DNA plasmidial. A estrutura linear de dupla hélice do DNA é destruída e desnaturada, enquanto DNA de plasmídeo circular covalentemente fechado, embora desnaturado sob forte alcalinidade(pH 12.6) condições, ainda tem duas vertentes complementares que estão interligadas e intimamente associadas. Quando pH 4,8 acetato de potássio(ou acetato de sódio) solução tampão com alto teor de sal é adicionada para restaurar a neutralidade, DNA de plasmídeo circular covalentemente fechado renatura rapidamente, enquanto o DNA cromossômico linear renatura lentamente. Proteínas bacterianas, paredes celulares rompidas, e o DNA cromossômico desnaturado se emaranhará em grandes complexos, que são cobertos por dodecilsulfato de sódio(FDS). O DNA plasmidial pode ser recuperado do sobrenadante após centrifugação para remover o desnaturante.

2. Lise fervente

A lise por ebulição é particularmente adequada para pequenos plasmídeos com menos de 15 KB. Este método envolve a suspensão de bactérias em um tampão contendo Triton X-100 e lisozima que pode digerir a parede celular., em seguida, aquecendo a 100°C para causar lise. O aquecimento não apenas destrói a parede celular, mas também ajuda a desembaraçar o emparelhamento de bases da cadeia de DNA e desnaturar proteínas e DNA cromossômico.. O DNA plasmídico circular fechado não se separa um do outro porque suas estruturas fosfodiéster estão entrelaçadas em uma estrutura topológica. Quando a temperatura cai, as bases do DNA circular fechado retornam às suas posições, formando uma molécula superenrolada. O DNA plasmidial pode ser recuperado do sobrenadante após centrifugação para remover nucleoproteínas cromossômicas desnaturadas.

3. Extração em uma etapa Mini-Prep

A extração em uma etapa mini-prep é baseada no fato de que o DNA cromossômico bacteriano é muito maior que o DNA plasmidial. O DNA cromossômico bacteriano é cortado em diferentes tamanhos de fragmentos lineares que aderem aos restos celulares e se tornam desnaturados sob força mecânica. Embora o DNA plasmídico também seja desnaturado, ele renatura rapidamente após o desaparecimento da força mecânica, permanecendo solúvel na solução, enquanto o DNA cromossômico bacteriano renatura lentamente, formando uma estrutura reticular insolúvel. O DNA plasmidial pode ser separado por centrifugação de alta velocidade.

4. Aplicação de Colunas de Purificação

As colunas de purificação são geralmente compostas por uma camada de membrana de silicone,  que pode adsorver seletivamente DNA, e esse processo é reversível. Os grupos silanol na superfície da membrana de silicone ficam carregados negativamente após a dissociação na solução, formando uma ponte elétrica com íons de sal carregados positivamente e DNA carregado negativamente, adsorvendo assim o DNA. A membrana de silicone adsorve seletivamente o DNA sob condições de alto teor de sal e baixo pH, e a membrana de silicone libera DNA sob condições de baixo teor de sal e alto pH, .

5. Extração de ácido nucleico pelo método de esferas magnéticas

Moléculas de DNA se ligam às moléculas carregadas positivamente (como grupos químicos carregados positivamente) na superfície de contas magnéticas através de suas estruturas de fosfato carregadas negativamente por meio de ligação eletrostática em pH específico, concentração de sal, e temperatura. Esta ligação é específica, garantindo que apenas as moléculas de DNA alvo se liguem às esferas magnéticas. Em alguns casos, como quando PEG (polietilenoglicol) e íons de sal são adicionados, a conformação das moléculas de DNA sofre mudanças drásticas. O estado linear é comprimido em um estado esférico enrolado, o que torna o DNA mais fácil de se ligar a esferas magnéticas. Ao mesmo tempo, Moléculas de DNA de diferentes comprimentos sofrem precipitação seletiva sob a ação de PEG e íons salinos, conseguindo assim a separação de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes.

Método de conta magnética dupla: Esta é uma tecnologia desenvolvida com base no princípio da extração de plasmídeos, usando dois tipos de esferas magnéticas com funções diferentes. A esfera magnética I é usada para remover detritos bacterianos após a lise, enquanto a conta magnética II é usada para a separação específica de moléculas de ácido nucleico. Sob a ação do tampão de lise, SDS combina com restos bacterianos, proteínas, e outras impurezas para formar um potássio insolúvel (ou sódio) complexo de precipitado de sal, que tem uma carga positiva devido à combinação de uma grande quantidade de K⁺ (ou Na⁺). Conta magnética I, com um grande número de esferas magnéticas de policarboxilato carregadas negativamente, pode adsorver especificamente impurezas por meio de adsorção eletrostática e coordenação com o K carregado positivamente⁺ (ou Na⁺) complexo. A conta magnética II possui uma superfície modificada com abundantes grupos silanol, que pode adsorver especificamente ácidos nucleicos em um ambiente solvente de álcool, baseado neste princípio, a separação específica do DNA plasmídico pode ser alcançada.

O DNA plasmidial pode ser efetivamente separado das células hospedeiras e sua pureza e integridade podem ser garantidas pelos métodos acima., estabelecendo uma base sólida para experimentos subsequentes de biologia molecular.

Fornecedor

Xangai Lingjun Biotecnologia Co., Ltda.foi estabelecido em 2016 que é um fabricante profissional de materiais biomagnéticos e reagentes de extração de ácido nucleico.

Temos vasta experiência em extração e purificação de ácidos nucleicos, purificação de proteínas, separação celular, quimioluminescência e outros campos técnicos.

Nossos produtos são amplamente utilizados em muitos campos, como exames médicos, testes genéticos, pesquisa universitária, melhoramento genético, e assim por diante. Nós não apenas fornecemos produtos, mas também podemos realizar OEM, ODM, e outras necessidades. Se você tiver uma necessidade relacionada, não hesite em contactar-nos emsales01@lingjunbio.com.