Hoe plasmide-DNA te onderscheiden van chromosomaal DNA tijdens extractie?

Plasmide-DNA-extractie is een fundamentele en belangrijke techniek in moleculair biologisch onderzoek. De sleutel tot het onderscheiden van plasmide-DNA van chromosomaal DNA ligt in hun verschillen in fysische en chemische eigenschappen. Hier zijn verschillende veelgebruikte methoden voor differentiatie.

1. Alkalische Lysis

De alkalische lyse is een van de meest gebruikte methoden voor plasmide-DNA-extractie. Het principe is gebaseerd op de verschillen in topologische structuur tussen chromosomaal DNA en plasmide-DNA. In een sterk alkalisch milieu worden de bacteriële celwand en het celmembraan verstoord, het vrijgeven van chromosomaal DNA en plasmide-DNA. De lineaire DNA-dubbele helixstructuur wordt vernietigd en gedenatureerd, terwijl het covalent gesloten circulair plasmide-DNA is, hoewel gedenatureerd onder sterke alkalische stoffen(pH 12.6) voorwaarden, heeft nog steeds twee complementaire onderdelen die met elkaar verweven en nauw verbonden zijn. Bij pH 4,8 acetaatkalium(of natriumacetaat) Er wordt een zoutrijke bufferoplossing toegevoegd om de neutraliteit te herstellen, covalent gesloten circulair plasmide-DNA renatureert snel, terwijl lineair chromosomaal DNA langzaam renatureert. Bacteriële eiwitten, gescheurde celwanden, en gedenatureerd chromosomaal DNA zal verstrikt raken in grote complexen, die bedekt zijn met natriumdodecylsulfaat(SDS). Plasmide-DNA kan na centrifugatie uit het supernatant worden teruggewonnen om het denatureringsmiddel te verwijderen.

2. Kokende Lysis

Kokende lyse is bijzonder geschikt voor kleine plasmiden van minder dan 15 kb. Deze methode omvat het suspenderen van bacteriën in een buffer met Triton X-100 en lysozym die de celwand kunnen verteren, vervolgens verwarmen tot 100°C om lyse te veroorzaken. Verwarming vernietigt niet alleen de celwand, maar helpt ook bij het ontwarren van de basenparing van de DNA-streng en het denatureren van eiwitten en chromosomaal DNA. Gesloten circulair plasmide-DNA scheidt niet van elkaar omdat hun fosfodiëster-skeletten met elkaar verweven zijn in een topologische structuur. Wanneer de temperatuur daalt, de basen van het gesloten circulaire DNA keren terug naar hun posities, waardoor een supercoiled molecuul ontstaat. Plasmide-DNA kan na centrifugatie uit het supernatant worden teruggewonnen om gedenatureerde chromosomale nucleoproteïnen te verwijderen.

3. Mini-Prep-extractie in één stap

De mini-prep-extractie in één stap is gebaseerd op het feit dat bacterieel chromosomaal DNA veel groter is dan plasmide-DNA. Bacterieel chromosomaal DNA wordt geknipt in lineaire fragmenten van verschillende groottes die zich hechten aan celresten en onder mechanische kracht worden gedenatureerd. Hoewel plasmide-DNA ook gedenatureerd is, het renatureert snel nadat de mechanische kracht is verdwenen, oplosbaar blijven in de oplossing, terwijl bacterieel chromosomaal DNA langzaam renatureert, waardoor een onoplosbare reticulaire structuur ontstaat. Plasmide-DNA kan worden gescheiden door centrifugatie met hoge snelheid.

4. Toepassing van zuiveringskolommen

Zuiveringskolommen bestaan ​​doorgaans uit een laag siliconenmembraan,  die selectief DNA kunnen adsorberen, en dit proces is omkeerbaar. De silanolgroepen op het oppervlak van het siliconenmembraan worden na dissociatie in de oplossing negatief geladen, het vormen van een elektrische brug met positief geladen zoutionen en negatief geladen DNA, waardoor DNA wordt geadsorbeerd. Het siliconenmembraan adsorbeert selectief DNA onder omstandigheden met een hoog zoutgehalte en een lage pH, en het siliconenmembraan geeft DNA vrij onder zoutarme en hoge pH-omstandigheden, .

5. Nucleïnezuurextractie door middel van magnetische kralenmethode

DNA-moleculen binden zich aan de positief geladen moleculen (zoals positief geladen chemische groepen) op het oppervlak van magnetische kralen via hun negatief geladen fosfaatskeletten via elektrostatische binding bij een specifieke pH, zout concentratie, en temperatuur. Deze binding is specifiek, ervoor te zorgen dat alleen de doel-DNA-moleculen aan de magnetische kralen binden. In sommige gevallen, zoals wanneer PIN (polyethyleenglycol) en zoutionen worden toegevoegd, de conformatie van DNA-moleculen ondergaat drastische veranderingen. De lineaire toestand wordt gecomprimeerd tot een gekrulde bolvormige toestand, waardoor DNA gemakkelijker te binden is met magnetische kralen. Tegelijkertijd, DNA-moleculen met verschillende lengtes ondergaan selectieve precipitatie onder invloed van PEG en zoutionen, waardoor de scheiding van DNA-fragmenten van verschillende groottes wordt bereikt.

Dubbele magnetische kraalmethode: Dit is een technologie die is ontwikkeld op basis van het principe van plasmide-extractie, met behulp van twee soorten magnetische kralen met verschillende functies. Magnetische kraal I wordt gebruikt om bacterieel afval na lyse te verwijderen, terwijl magnetische kraal II wordt gebruikt voor de specifieke scheiding van nucleïnezuurmoleculen. Onder invloed van lysisbuffer, SDS combineert met bacterieel afval, eiwitten, en andere onzuiverheden om een ​​onoplosbaar kalium te vormen (of natrium) zoutneerslagcomplex, die een positieve lading heeft door de combinatie van een grote hoeveelheid K⁺ (of Na⁺). Magnetische kraal I, met een groot aantal negatief geladen magnetische polycarboxylaatkorrels, kan specifiek onzuiverheden adsorberen door middel van elektrostatische adsorptie en coördinatie met de positief geladen K⁺ (of Na⁺) complex. Magnetische kraal II heeft een oppervlak dat is gemodificeerd met overvloedige silanolgroepen, die specifiek nucleïnezuren kunnen adsorberen in een alcoholoplosmiddelomgeving, gebaseerd op dit principe, de specifieke scheiding van plasmide-DNA kan worden bereikt.

Plasmide-DNA kan effectief worden gescheiden van de gastheercellen en de zuiverheid en integriteit ervan kan worden verzekerd door de bovenstaande methoden, het leggen van een solide basis voor daaropvolgende experimenten in de moleculaire biologie.

Leverancier

Shanghai Lingjun Biotechnologie Co., Ltd.werd opgericht in 2016 dat een professionele fabrikant is van biomagnetische materialen en reagentia voor nucleïnezuurextractie.

We hebben een rijke ervaring in de extractie en zuivering van nucleïnezuren, eiwit zuivering, cel scheiding, chemiluminescentie en andere technische gebieden.

Onze producten worden op veel gebieden veel gebruikt, zoals medische testen, genetische testen, universitair onderzoek, genetische veredeling, enzovoort. Wij leveren niet alleen producten, maar kunnen ook OEM ondernemen, ODM, en andere behoeften. Als u een gerelateerde behoefte heeft, neem dan gerust contact met ons op viasales01@lingjunbio.com.