Optimering af H. pylori-påvisning med magnetisk perle-DNA-ekstraktion

Indledning

Magnetisk perle-baseret nukleinsyreekstraktion er i øjeblikket mainstream- og guldstandardteknologien, der spiller en afgørende rolle i den molekylære detektion af Helicobacter pylori (H. pylori). I dag, vi vil udforske ansøgningen i detaljer, specifikke protokoller, og fremtidsudsigter for magnetisk perle-baseret nukleinsyreekstraktionsteknologi i Helicobacter pylori nukleinsyretest.

1. Anvendelse: Hvorfor er den magnetiske perlemetode særligt egnet til H. pylori Nukleinsyretestning?

Prøver til H. pylori-påvisning omfatter typisk maveslimhindevæv (biopsi), afføring, spyt, eller tandplak. Disse prøver er komplekse i sammensætning, indeholdende store mængder værtsceller, slim, madrester, galdesyrer, og forskellige PCR-hæmmere.

Derfor, effektiv og ren nukleinsyreekstraktion er afgørende for at sikre nøjagtigheden af ​​efterfølgende nukleinsyretests (såsom qPCR, digital PCR, og sekventering).

1.1 Den magnetiske perlemetode giver betydelige fordele i denne sammenhæng

• Høj renhed og udbytte: Magnetiske perler adsorberer effektivt nukleinsyrer og fjerner urenheder såsom proteiner, polysaccharider, og lipider gennem flere vasketrin. De er særligt effektive til at eliminere PCR-hæmmere i komplekse gastrointestinale prøver, i høj grad forbedre detektionsfølsomhed og specificitet.
• Automatisering og høj gennemstrømning: Den magnetiske perlemetode er meget modtagelig for automatisering. Adskillige automatiserede nukleinsyreekstraktionsinstrumenter er tilgængelige, som kan behandle snesevis eller endda hundredvis af prøver samtidigt, markant forbedring af effektiviteten, reducere menneskelige fejl, og opfylde kravene til storskala klinisk testning og epidemiologisk screening.
• Sikkerhed og enkelhed: Hele processen udføres i forseglede dybbrøndsplader, minimere aerosolkontamination og reducere operatører’ udsættelse for farlige reagenser, og dermed øge biosikkerheden.
• Fleksibilitet: Metoden er velegnet til forskellige prøvetyper, herunder mavevæv, afføring, og mundtlige prøver, med mindre justeringer af lyseringsbufferen配方 og driftsparametre.
• Standardisering: Automatiserede processer sikrer høj standardisering, pålidelige resultater, og lette sammenligninger og kvalitetskontrol mellem laboratorier.

2. Protokol: Magnetisk perlebaseret nukleinsyreekstraktion og detektionsworkflow for H. pylori

Følgende er en standard automatiseret magnetisk perle-baseret protokol til udtrækning af H. pylori DNA (ved at bruge mavevævs- eller afføringsprøver som eksempler):

2.1 Prøve forbehandling

Maveslimhindevæv: Placer biopsivæv i et PBS-holdigt centrifugerør og homogeniser grundigt ved hjælp af en vævskværn.

Afføringsprøve: Suspender et lille beløb (f.eks., 100–200 mg) af afføringsprøve i en specifik prøvekonserveringsopløsning eller PBS-buffer, vortex at blande, og centrifuger for at opsamle supernatanten.

2.2 Nukleinsyreekstraktion (Brug af et 96-brønds automatiseret ekstraktionssystem)

Lysis: Tage 200 μL af den behandlede prøvesupernatant og tilsæt den til en kraftig lysisbuffer indeholdende proteinase K (f.eks., et guanidin-HCl-baseret denaturerende saltsystem). Inkuber ved 60-70°C i 10-20 minutter for at lysere celler og bakterier fuldstændigt, frigiver nukleinsyrer, og inaktivere eventuelle potentielle nukleaser.

Indbinding: Tilføj bindingsbuffer og magnetisk perlesuspension til lysatet og bland. Under den høje ionstyrke af det denaturerende salt, DNA adsorberes specifikt på overfladen af ​​de magnetiske perler. Efter inkubation i flere minutter, fange perle-DNA-komplekserne ved hjælp af et magnetisk stativ og kasser supernatanten.

Vask:

Vaskebuffer I: Indeholder typisk høje koncentrationer af salt og ethanol til at fjerne proteiner, lipider, og andre urenheder.

Vaskebuffer II: Indeholder normalt lave koncentrationer af salt og ethanol for at fjerne salte og resterende inhibitorer.

Efter hvert vasketrin, resuspender perlerne, fange dem, og kassér væsken. Gentag 2-3 gange.

Tørring: Efter fuldstændig fjernelse af vaskebufferen, lad røret stå åbent ved stuetemperatur i et par minutter eller påfør mild varme for at lade resterende ethanol fordampe helt, undgå interferens med efterfølgende PCR-reaktioner.

Eluering: Tilføj en saltfattig eller saltfri elueringsbuffer (f.eks., Tris-EDTA buffer eller sterilt vand), resuspender perlerne, og inkuber ved 55-65°C i 5-10 minutter for at adskille DNA'et fra perlerne. Endelig, fange perlerne ved hjælp af et magnetisk stativ, og den resulterende supernatant indeholder det oprensede H. pylori DNA skabelon.

2.3 Nukleinsyrepåvisning

Tilføj den ekstraherede DNA skabelon til en real-time kvantitativ PCR (qPCR) reaktionssystem.

Målgener: Almindeligt udvalgte meget specifikke konserverede gener af H. pylori omfatter:

• Urease A-gen (ureA): Mest brugt, med ekstrem høj specificitet.
• 16S rRNA gen: Meget konserveret, egnet til identifikation på slægtsniveau.
• cagA-gen: Et virulensgen, der bruges til at skelne mellem højvirulensstammer.

Reaktion: Udfør amplifikation i et qPCR-instrument og overvåg fluorescenssignalet for at bestemme resultater. Positive prøver vil vise en karakteristisk S-formet amplifikationskurve.

Kvalitetskontrol

Intern kontrol (IC): Tilføjet i begyndelsen af ​​ekstraktion for at overvåge succesen af ​​hele processen og undgå falske negativer.

Positive og negative kontroller: Inkluderet i hvert forsøg for at sikre effektiviteten af ​​ekstraktion og PCR-reagenser.

3. Udsigter og fremtidige retninger

Udsigterne for magnetisk perle-baseret nukleinsyreekstraktionsteknologi i H. pylori-detektion er omfattende og vil udvikle sig i følgende retninger:

• Fuldt integreret “Prøve ind, Resultat-ud” Systemer: Fremtidige tendenser involverer integration af nukleinsyreekstraktion, forstærkning, og detektion i en enkelt mikrofluidisk chip eller patron. Brugere behøver kun at tilføje prøven, og instrumentet fuldfører automatisk hele processen og genererer en rapport. Dette vil i høj grad forenkle operationer, forkorte detektionstiden (potentielt indenfor 1 time), og gør den særdeles velegnet til ambulatorier, primære sygehuse, og endda hjemmebrug.
• Multiplex detektion og lægemiddelresistens genanalyse: Nukleinsyrer af høj kvalitet ekstraheret via den magnetiske perlemetode understøtter multiplex qPCR-testning. En enkelt reaktion kan ikke kun bestemme H. pylori-infektion, men også opdage flere lægemiddelresistensgener (f.eks., clarithromycin resistens mutation 23S rRNA, levofloxacin resistens mutation gyrA), integrere molekylær diagnose og lægemiddelfølsomhedstest for at give direkte vejledning til præcis klinisk behandling.
• Metagenomics og Strain Typing: Højkvalitets DNA-ekstraktion er en forudsætning for metagenomisk sekventering (mNGS). Den magnetiske perlemetode kan levere skabeloner af høj kvalitet til mNGS, muliggør forskning i H. pylori mikrobiota mangfoldighed, evolutionære forhold, og interaktioner med andre mikroorganismer i infektionsmikromiljøet, derved fremme dybere mekanistiske studier.
• Popularisering af ikke-invasiv testning: Taburet-baseret H. pylori DNA-test (afføringsantigentest, SAT) er en fremragende ikke-invasiv metode. Modningen af ​​automatiseret magnetisk perlebaseret ekstraktion vil gøre storstilet afføringsscreening mulig, velegnet til børn, personer, der ikke tåler endoskopi, og effektovervågning efter behandling.
• Kontinuerlig teknologisk optimering: Magnetiske perler, bufferformuleringer, og instrumentdesign vil fortsat blive optimeret for at opnå hurtigere (afkortning til inde 20 minutter), mere omkostningseffektiv (reduktion af omkostningerne pr. test), og grønnere (ved at bruge mere miljøvenlige reagenser) ekstraktion af nukleinsyrer med højere renhed.

4. Produktanbefaling

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd. tilbyder forskellige modeller af silica-baserede magnetiske perler, der er meget udbredt i patogensygdomsdiagnostik, især 160013 magnetiske perler, som er egnede til Helicobacter pylori-nukleinsyreekstraktion. De 160013 magnetiske perler giver ekstrem høj detektionsfølsomhed, muliggør tidlig screening under infektion og værdifuld tid til sygdomsbekæmpelse og forebyggelse.

【Produktspecifikationer】

Produktkode: 160013

Solid indhold: 50 mg/ml

Emballage: 2 ml / 10 ml / 50 ml / 500 ml / 1000 ml

【Produktparametre】

Aktiv gruppe: Si-OH

Magnetisk perlematrix: Siliciumdioxid

Gennemsnitlig partikelstørrelse: 1.2 µm

Magnetisk mætningsstyrke: 65 ± 5 emu/g

【Produktfordele】

Høj adsorptionshastighed: Maksimal genvindingsgrad overstiger 95%.

Fremragende affjedring og stærke magnetiske egenskaber for nem betjening.

Høj renhed og følsomhed i nukleinsyreekstraktion.

Moden produktionsproces med fremragende batch-til-batch-konsistens.

Konklusion

Magnetisk perlebaseret nukleinsyreekstraktionsteknologi, med sine fordele ved automatisering, høj gennemstrømning, høj renhed, og høj sikkerhed, er blevet guldstandardmetoden til nukleinsyrefremstilling i Helicobacter pylori molekylær diagnostik. Det sikrer ikke kun pålideligheden af ​​nuværende qPCR-test, men fungerer også som et nøgleteknologisk grundlag for hurtige fremskridt, præcis, og ikke-invasiv diagnose af H. pylori infektion. I takt med at molekylære teknologier fortsætter med at udvikle sig og integreres, anvendelsen af ​​magnetiske perler-baserede metoder på dette område vil kun blive mere dybtgående og udbredt.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.blev etableret i 2016 som er en professionel producent af biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraktionsreagenser.

Vi har stor erfaring med udvinding og oprensning af nukleinsyre, proteinoprensning, celleadskillelse, kemiluminescens, og andre tekniske områder.

Vores produkter er meget udbredt inden for mange områder, såsom medicinsk test, genetisk testning, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke kun produkter, men kan også påtage os OEM, ODM, og andre behov. Hvis du har et relateret behov, er du velkommen til at kontakte os .