DNA断片分類の研究と進歩

固相可逆固定化 (SPRI) 技術は過去にも DNA 単離に使用されてきました 20 年. その中で, 超常磁性カルボキシル化磁気ビーズは、ポリエチレングリコールの条件下でさまざまなサイズの DNA 分子を選択的に沈殿させるために使用されます。 (ペグ) パーセントと塩分濃度, 得られた生成物は、NGS サンプル ライブラリの調製に使用できます。. このメソッドの重要なポイントの 1 つは、臨界 PEG 値の決定です。これは、DNA 断片の選択的分離にとって最も重要なパラメーターであるためです。.

これまでの研究では、DNA断片の選択的単離がコイルドコイルから球状へのDNA形態の立体構造変化と関連していることが判明した。. 以前, 研究者らは、DNA分子がコイル状から球状への移行を誘導する臨界PEG濃度を決定するために、さまざまな方法を使用してきました。, 沈殿などの, 蛍光イメージング, 粘度, UV/Vis遠心分離, 動的光散乱 (DLS), と円二色性. しかし, 球状の DNA 分子は固体表面に沈殿するため、これらの方法は磁気ビーズを含む DNA 溶液には適用されませんでした。. したがって, その後の研究者は、ゲル電気泳動を使用して、特定のサイズの DNA 断片の臨界 PEG 濃度を決定しました。, しかし, この方法にはいくつかの欠点があります, 比較的長い電気泳動時間や臨界値の精度が低い結果など.

したがって, で 2013, 何張勇ら。 ^[1] 異なる濃度のポリエチレングリコールの影響を研究するために使用されます。 (ペグ) 存在下での DNA 断片の回収について 1 一定濃度の塩化ナトリウムでμm カルボキシル化磁性ビーズ (塩化ナトリウム). 彼らはまた、ロジスティック関数によってそれらの濃度をPEG濃度に適合させ、適合したロジスティック関数から臨界PEG値を決定しました。. これに基づいて, 彼らは、一次導関数を導出することで回収方程式の勾配関数を取得し、これらのパラメーターに基づいて勾配関数を使用して、異なるフラグメントを分離するための NaCl と PEG の濃度を決定できる DNA フラグメント回収スペクトルを構築しました。 ^[2]. これに加えて, 彼らは研究で、pH がシステムの有効性に影響を与えず、PEG の分子量サイズが必要な濃度の大きさに反比例することを発見しました。.

以前は E. フレーリッヒら ^[3] DNAとポリエチレングリコールの結合を研究した (ペグ) さまざまなサイズと構成の (例えば, ペグ 3350, ペグ 6000, および MPEG アントラセン) 塩イオン溶液中で. 構造分析により、PEG が 3350 およびPEG 6000 中程度の複合体を形成した, 一方、mPEG-アントラセン-DNA付加物は、接触している親水基および疎水基と弱い相互作用を示しました。. 形成された複合体の安定性はPEGのオーダーでした 6000 > ペグ 3350 > mPEG-アントラセン, DNA ごとにほぼ 1 つの PEG 分子が結合します. B-DNA では構造変化は観察されませんでした, 一方、より高いPEG濃度では、DNAが凝縮して粒子を形成します.

加えて, リンリン・リウ 他^[2] 周囲の pH に応じて DNA 断片とリジン官能基化シリカ粒子の表面との間の静電相互作用を調整することにより、リジン シリカ粒子を二元および三元 DNA 混合物のサイズ選択的分離に使用できることを実証しました。, 特に, イオン強度. DNA断片の電荷, およびそれらと逆に帯電したシリカ粒子の表面との間の静電相互作用, 環境のpHによって決定されました. DNA フラグメントの電荷と、逆に帯電したシリカ粒子の表面との静電相互作用は、DNA フラグメントのサイズと密接に関係しています。, Lys-SiO2 粒子を使用した DNA 断片の選択的分離のメカニズムを図に示します。 1.

で 2020 アレクセイら ^[4] DNA断片の選択的単離の間隔をずらした 150-800 血圧から 1.5-7 磁気ビーズバッファー中の NaCl 濃度を調整することによる Kbp. NaClを他の陽イオンに置き換えてポリエチレングリコールの濃度を下げる場合 (ペグ) 8000, 選択的に分離されたDNA断片の間隔は変化しました, ここではLiClが最も効果的です.

2023 ダンリら ^[5] 臨界濃度のポリエチレングリコールの最大回収率をテストしました (ペグ) 8000 そして 300 nmカルボキシル化磁性ビーズ, カルボキシル化磁性ビーズの磁性ビーズバッファー組成の決定 20% ペグ 8000, 2M NaCl, そして 16.3 mM MgCl2, とともに 1.25 mg/ml磁気ビーズ. 次に、彼らはコントロールのベックマンと同等の DNA 回収プロトコルをテストしました。 (AMPure XP 磁気ビーズ).

磁気ビーズの種類によってパラメータが異なるため、リザーブバッファーは汎用的ではありません。. しかし, 研究者は誰でも、効率的な回収やさまざまな実験目的のために、既知のデータ結果に基づいて磁気ビーズ懸濁液バッファーをさらに最適化できます。. 標準的な市販の DNA 精製方法から、SPRI ビーズ濃度および最適なビーズ懸濁液バッファーの調整まで, これにより、研究者はさまざまな DNA 操作条件に対応できる柔軟性と利便性を得ることができます。. 加えて, さまざまな DNA 精製戦略は、生物学および医療分野での応用に大きな可能性を秘めています.

参照：

[1] HE Z, ジュー・イ, へH. DNA 断片の選択的沈殿のための臨界ポリエチレングリコール濃度を決定するための新しい方法[J/OL]. 応用微生物学とバイオテクノロジー, 2013, 97(20): 9175-9183. 土肥:10.1007/s00253-013-5195-0.

[2] HE Z, シュ・H, シオン・M, 他. サイズ選択的 DNA 分離: 回収スペクトルは塩化ナトリウムの測定に役立ちます (塩化ナトリウム) およびポリエチレングリコール (ペグ) 必要な濃度[J/OL]. バイオテクノロジージャーナル, 2014, 9(10): 1241-1249. 土肥:10.1002/biot.201400234.

[3] PEG および mPEG-アントラセンは DNA の凝縮と粒子形成を誘発します | 物理化学ジャーナル B[EB/OL]. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp205079u.

[4] ストルチェヴォイA, カメラN, レバイン S S. 2～10kbの範囲でのSPRIビーズベースのサイズ選択[J/OL]. 生体分子技術ジャーナル : JBT, 2020, 31(1): 7-10. 土肥:10.7171/等 20-3101-002.

[5] リュー・D, リク, ルオ・ジェイ, 他. 柔軟性と費用対効果を実現する SPRI ビーズベースの DNA 精製戦略[J/OL]. BMCゲノミクス, 2023, 24(1): 125. 土肥:10.1186/s12864-023-09211-w.

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