Ricerca e progressi nello smistamento dei frammenti di DNA

Immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) in passato sono state utilizzate tecniche per l'isolamento del DNA 20 anni. In esso, Le sfere magnetiche carbossilate superparamagnetiche vengono utilizzate per precipitare selettivamente molecole di DNA di diverse dimensioni in condizioni di polietilenglicole (PEG) percentuale e concentrazione di sale, e i prodotti ottenuti possono essere utilizzati per preparare librerie di campioni NGS. Uno dei punti chiave del metodo è la determinazione del valore critico PEG poiché questo è il parametro più importante per la separazione selettiva dei frammenti di DNA.

Studi precedenti hanno scoperto che l’isolamento selettivo dei frammenti di DNA è associato a uno spostamento conformazionale nella morfologia del DNA da a spirale a globulare.. Precedentemente, i ricercatori hanno utilizzato una varietà di metodi per determinare la concentrazione critica di PEG che induce la transizione delle molecole di DNA da arrotolate a sferiche, come la sedimentazione, imaging in fluorescenza, viscosità, Centrifugazione UV/Vis, e diffusione dinamica della luce (DLS), e dicroismo circolare. Tuttavia, questi metodi non si applicavano alle soluzioni di DNA contenenti biglie magnetiche perché le molecole globulari di DNA precipiterebbero su superfici solide. Perciò, successivamente i ricercatori hanno utilizzato l'elettroforesi su gel per determinare la concentrazione critica di PEG per frammenti di DNA di una dimensione specifica, Tuttavia, questo metodo presenta diversi svantaggi, come il tempo di elettroforesi relativamente lungo e risultati meno accurati per i valori critici.

Perciò, In 2013, He Zhangyong et al. ^[1] utilizzato per studiare l'effetto di diverse concentrazioni di polietilenglicole (PEG) sul recupero di frammenti di DNA in presenza di 1 Microsfere magnetiche carbossilate a concentrazione fissa di cloruro di sodio (NaCl). Hanno inoltre adattato le loro concentrazioni alla concentrazione di PEG mediante una funzione logistica e determinato il valore critico del PEG dalla funzione logistica adattata. Su questa base, hanno ottenuto la funzione di pendenza dell'equazione di recupero derivando le sue derivate del primo ordine e hanno utilizzato la funzione di pendenza basata su questi parametri per costruire uno spettro di recupero di frammenti di DNA in grado di determinare la concentrazione di NaCl e PEG per la separazione di diversi frammenti ^[2]. Oltre a questo, nel loro studio hanno scoperto che il pH non ha alcun effetto sull'efficacia del loro sistema e che la dimensione del peso molecolare del PEG è inversamente proporzionale alla dimensione della concentrazione richiesta.

Mentre in precedenza E. Froehlich et al ^[3] hanno studiato il legame del DNA ai polietilenglicoli (PEG) di diverse dimensioni e composizioni (per esempio., PEG 3350, PEG 6000, e MPEG-antracene) in soluzioni sale-ioniche. L'analisi strutturale ha mostrato che PEG 3350 e PEG 6000 formano complessi moderati, mentre gli addotti mPEG-antracene-DNA avevano deboli interazioni con i gruppi idrofili e idrofobi in contatto. La stabilità dei complessi formati era nell'ordine del PEG 6000 > PEG 3350 > mPEG-antracene, con quasi una molecola di PEG legata al DNA. Non sono stati osservati cambiamenti conformazionali per il B-DNA, mentre a concentrazioni più elevate di PEG il DNA si condensa e forma particelle.

Inoltre, Lingling Liu et al^[2] ha dimostrato che le particelle di silice di lisina potrebbero essere utilizzate per la separazione selettiva per dimensione di miscele di DNA binario e ternario regolando le interazioni elettrostatiche tra i frammenti di DNA e la superficie delle particelle di silice funzionalizzata con lisina in base al pH ambientale, in particolare, la forza ionica. La carica dei frammenti di DNA, e le interazioni elettrostatiche tra loro e la superficie di particelle di silice con carica opposta, è stato determinato dal pH dell'ambiente. La carica dei frammenti di DNA e le loro interazioni elettrostatiche con la superficie delle particelle di silice con carica opposta sono strettamente correlate alla dimensione dei frammenti di DNA, e il meccanismo di separazione selettiva dei frammenti di DNA utilizzando particelle Lys-SiO2 è mostrato in Figura 1.

In 2020 Alexei et al ^[4] spostato l'intervallo di isolamento selettivo dei frammenti di DNA di 150-800 bp a 1.5-7 Kbp regolando la concentrazione di NaCl nel tampone di sfere magnetiche. Quando si sostituisce NaCl con altri cationi e si abbassa la concentrazione di polietilenglicole (PEG) 8000, gli intervalli dei frammenti di DNA selettivamente separati variavano, con LiCl che è il più efficace qui.

2023 Danli et al ^[5] testato il recupero massimizzato delle concentrazioni critiche di polietilenglicole (PEG) 8000 E 300 sfere magnetiche carbossilate nm, determinazione di una composizione tampone di sfere magnetiche per sfere magnetiche carbossilate di 20% PEG 8000, 2M NaCl, E 16.3 mM MgCl2, insieme a 1.25 sfere magnetiche mg/ml. Hanno poi testato il protocollo per il recupero del DNA paragonabile a un controllo Beckman (Sfere magnetiche AMPure XP).

I buffer di riserva non sono universali a causa dei diversi parametri dei diversi tipi di sfere magnetiche. Tuttavia, qualsiasi ricercatore può ottimizzare ulteriormente il buffer di sospensione delle sfere magnetiche sulla base dei risultati dei dati noti per un recupero efficiente o per diversi scopi sperimentali. Dai metodi commerciali standard di purificazione del DNA alla regolazione delle concentrazioni di sferette SPRI e ai tamponi di sospensione ottimali delle sferette, ciò può fornire ai ricercatori una grande flessibilità e praticità per le diverse condizioni di manipolazione del DNA. Inoltre, diverse strategie di purificazione del DNA hanno un grande potenziale di applicazione in campo biologico e medico.

Riferimento：

[1] LUI Z, ZHU Y, AH. Un nuovo metodo per la determinazione della concentrazione critica di polietilenglicole per la precipitazione selettiva di frammenti di DNA[J/OL]. Microbiologia applicata e Biotecnologie, 2013, 97(20): 9175-9183. DOI:10.1007/s00253-013-5195-0.

[2] LUI Z, XUH, XIONG M, et al. Separazione del DNA selettiva per dimensione: Gli spettri di recupero aiutano a determinare il cloruro di sodio (NaCl) e polietilenglicole (PEG) concentrazioni richieste[J/OL]. Giornale della biotecnologia, 2014, 9(10): 1241-1249. DOI:10.1002/biot.201400234.

[3] PEG e mPEG-Antracene inducono la condensazione del DNA e la formazione di particelle | Il giornale di chimica fisica B[EB/OL]. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp205079u.

[4] STORTCHEVOI A, KAMELA N, LEVINE S S. Selezione delle dimensioni basata su microsfere SPRI nell'intervallo 2-10 kb[J/OL]. Giornale di tecniche biomolecolari : JBT, 2020, 31(1): 7-10. DOI:10.7171/ecc. 20-3101-002.

[5] LIU D, LIQ, LUO J, et al. Una strategia di purificazione del DNA basata su microsfere SPRI per flessibilità ed efficacia in termini di costi[J/OL]. Genomica BMC, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

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