Penelitian dan Kemajuan dalam Penyortiran Fragmen DNA

Imobilisasi reversibel fase padat (SPRI) teknik telah digunakan untuk isolasi DNA di masa lalu 20 bertahun-tahun. Di dalamnya, manik-manik magnetik karboksilat superparamagnetik digunakan untuk secara selektif mengendapkan molekul DNA dengan ukuran berbeda dalam kondisi polietilen glikol (PASAK) persentase dan konsentrasi garam, dan produk yang diperoleh dapat digunakan untuk menyiapkan perpustakaan sampel NGS. Salah satu poin penting dari metode ini adalah penentuan nilai kritis PEG karena ini adalah parameter terpenting untuk pemisahan fragmen DNA secara selektif..

Penelitian sebelumnya menemukan bahwa isolasi selektif fragmen DNA dikaitkan dengan pergeseran konformasi morfologi DNA dari kumparan-kumparan menjadi bulat.. Sebelumnya, para peneliti telah menggunakan berbagai metode untuk menentukan konsentrasi PEG kritis yang menginduksi transisi molekul DNA dari melingkar ke bola., misalnya sedimentasi, pencitraan fluoresensi, viskositas, Sentrifugasi UV/Vis, dan hamburan cahaya dinamis (DLS), dan dikroisme melingkar. Namun, metode ini tidak berlaku untuk larutan DNA yang mengandung manik-manik magnet karena molekul DNA globular akan mengendap pada permukaan padat. Karena itu, peneliti kemudian menggunakan elektroforesis gel untuk menentukan konsentrasi PEG kritis untuk fragmen DNA dengan ukuran tertentu, Namun, metode ini memiliki beberapa kelemahan, seperti waktu elektroforesis yang relatif lama dan hasil nilai kritis yang kurang akurat.

Karena itu, di dalam 2013, He Zhangyong dkk. ^[1] digunakan untuk mempelajari pengaruh berbagai konsentrasi polietilen glikol (PASAK) pada pemulihan fragmen DNA dengan adanya 1 μm manik-manik magnetik karboksilat pada konsentrasi natrium klorida tetap (NaCl). Mereka juga menyesuaikan konsentrasinya dengan konsentrasi PEG melalui fungsi logistik dan menentukan nilai kritis PEG dari fungsi logistik yang disesuaikan.. Atas dasar ini, mereka memperoleh fungsi kemiringan persamaan pemulihan dengan menurunkan turunan orde pertama dan menggunakan fungsi kemiringan berdasarkan parameter ini untuk membangun spektrum pemulihan fragmen DNA yang mampu menentukan konsentrasi NaCl dan PEG untuk pemisahan fragmen yang berbeda. ^[2]. Selain itu, mereka menemukan dalam penelitiannya bahwa pH tidak berpengaruh pada efektivitas sistem mereka dan bahwa ukuran berat molekul PEG berbanding terbalik dengan ukuran konsentrasi yang dibutuhkan..

Padahal sebelumnya E. Froehlich dkk ^[3] menyelidiki pengikatan DNA ke polietilen glikol (PASAK) dengan ukuran dan komposisi berbeda (misalnya, PASAK 3350, PASAK 6000, dan MPEG-antrasena) dalam larutan garam-ionik. Analisis struktur menunjukkan bahwa PEG 3350 dan PEG 6000 membentuk kompleks moderat, sedangkan hasil tambahan mPEG-antrasena-DNA memiliki interaksi yang lemah dengan gugus hidrofilik dan hidrofobik dalam kontak. Stabilitas kompleks yang terbentuk berada pada orde PEG 6000 > PASAK 3350 > mPEG-antrasena, dengan hampir satu molekul PEG terikat per DNA. Tidak ada perubahan konformasi yang diamati untuk B-DNA, sedangkan pada konsentrasi PEG yang lebih tinggi DNA memadat dan membentuk partikel.

Selain itu, Lingling Liu dkk^[2] menunjukkan bahwa partikel silika lisin dapat digunakan untuk pemisahan selektif ukuran campuran DNA biner dan terner dengan menyesuaikan interaksi elektrostatik antara fragmen DNA dan permukaan partikel silika yang difungsikan lisin sesuai dengan pH sekitar., secara khusus, kekuatan ionik. Muatan fragmen DNA, dan interaksi elektrostatik antara mereka dan permukaan partikel silika yang bermuatan berlawanan, ditentukan oleh pH lingkungan. Muatan fragmen DNA dan interaksi elektrostatiknya dengan permukaan partikel silika yang bermuatan berlawanan berkaitan erat dengan ukuran fragmen DNA., dan mekanisme pemisahan selektif fragmen DNA menggunakan partikel Lys-SiO2 ditunjukkan pada Gambar 1.

Di dalam 2020 Alexei dkk ^[4] menggeser interval isolasi selektif fragmen DNA 150-800 bp ke 1.5-7 Kbp dengan mengatur konsentrasi NaCl dalam magnetic bead buffer. Saat mengganti NaCl dengan kation lain dan menurunkan konsentrasi polietilenglikol (PASAK) 8000, interval fragmen DNA yang dipisahkan secara selektif bervariasi, dengan LiCl menjadi yang paling efektif di sini.

2023 Danli dkk ^[5] menguji pemulihan maksimal konsentrasi kritis polietilen glikol (PASAK) 8000 Dan 300 manik-manik magnetik karboksilat nm, menentukan komposisi penyangga manik magnetik untuk manik magnetik karboksilasi 20% PASAK 8000, 2M NaCl, Dan 16.3 mM MgCl2, bersama dengan 1.25 mg/ml manik-manik magnetik. Mereka kemudian menguji protokol pemulihan DNA yang sebanding dengan kontrol Beckman (Manik-manik magnetik AMPure XP).

Buffer cadangan tidak bersifat universal karena perbedaan parameter jenis manik magnetik yang berbeda. Namun, peneliti mana pun dapat lebih mengoptimalkan buffer suspensi manik magnetik berdasarkan hasil data yang diketahui untuk pemulihan yang efisien atau untuk tujuan eksperimen yang berbeda. Dari metode pemurnian DNA komersial standar hingga penyesuaian konsentrasi manik SPRI dan buffer suspensi manik yang optimal, hal ini dapat memberi para peneliti banyak fleksibilitas dan kenyamanan untuk berbagai kondisi manipulasi DNA. Selain itu, strategi pemurnian DNA yang berbeda memiliki potensi besar untuk diterapkan di bidang biologi dan medis.

Referensi：

[1] DIA Z, ZHU Y, KE H. Sebuah metode baru untuk penentuan konsentrasi polietilen glikol kritis untuk pengendapan selektif fragmen DNA[J/OL]. Mikrobiologi dan Bioteknologi Terapan, 2013, 97(20): 9175-9183. DOI:10.1007/s00253-013-5195-0.

[2] DIA Z, XU H, XIONG M, dkk. Pemisahan DNA selektif ukuran: Spektrum pemulihan membantu menentukan natrium klorida (NaCl) dan polietilen glikol (PASAK) konsentrasi yang dibutuhkan[J/OL]. Jurnal Bioteknologi, 2014, 9(10): 1241-1249. DOI:10.1002/biot.201400234.

[3] PEG dan mPEG – Anthracene Menginduksi Kondensasi DNA dan Pembentukan Partikel | Jurnal Kimia Fisika B[EB/OL]. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp205079u.

[4] STORCHEVOI A, KAMELA N, LEVINE S. Pemilihan Ukuran Berbasis Manik SPRI di Kisaran 2-10kb[J/OL]. Jurnal Teknik Biomolekuler : JBT, 2020, 31(1): 7-10. DOI:10.7171/dll.20-3101-002.

[5] LIU D, LIQ, LUO J, dkk. Strategi pemurnian DNA berbasis butiran SPRI untuk fleksibilitas dan efektivitas biaya[J/OL]. Genomik BMC, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

Pemasok

Shanghai Lingjun Bioteknologi Co., Ltd.didirikan pada 2016 yang merupakan produsen profesional bahan biomagnetik dan reagen ekstraksi asam nukleat.

Kami memiliki pengalaman yang kaya dalam ekstraksi dan pemurnian asam nukleat, pemurnian protein, pemisahan sel, kimialuminesensi, dan bidang teknis lainnya.

Produk kami banyak digunakan di berbagai bidang, misalnya tes kesehatan, pengujian genetik, penelitian universitas, pemuliaan genetik, dan sebagainya. Kami tidak hanya menyediakan produk tetapi juga dapat melakukan OEM, ODM, dan kebutuhan lainnya. Jika Anda memiliki kebutuhan terkait, jangan ragu untuk menghubungi kami dipenjualan01@lingjunbio.com.