Penyelidikan dan Kemajuan dalam Pengisihan Serpihan DNA

Imobilisasi boleh balik fasa pepejal (SPRI) teknik telah digunakan untuk pengasingan DNA sejak dahulu lagi 20 tahun. Di dalamnya, manik magnet karboksilat superparamagnet digunakan untuk memendakan molekul DNA secara selektif dengan saiz yang berbeza di bawah keadaan polietilena glikol (PEG) peratusan dan kepekatan garam, dan produk yang diperoleh boleh digunakan untuk menyediakan perpustakaan sampel NGS. Salah satu perkara utama kaedah ini ialah penentuan nilai PEG kritikal kerana ini adalah parameter yang paling penting untuk pemisahan terpilih serpihan DNA..

Kajian terdahulu mendapati bahawa pengasingan terpilih serpihan DNA dikaitkan dengan peralihan konformasi dalam morfologi DNA daripada gegelung bergelung ke globular.. Sebelum ini, penyelidik telah menggunakan pelbagai kaedah untuk menentukan kepekatan PEG kritikal yang mendorong peralihan molekul DNA daripada bergelung ke sfera., seperti pemendapan, pengimejan pendarfluor, kelikatan, Pengemparan UV/Vis, dan penyerakan cahaya dinamik (DLS), dan dikroisme bulat. Namun begitu, kaedah ini tidak digunakan untuk penyelesaian DNA yang mengandungi manik magnet kerana molekul DNA globular akan mendakan ke permukaan pepejal. Oleh itu, penyelidik kemudiannya telah menggunakan elektroforesis gel untuk menentukan kepekatan PEG kritikal untuk serpihan DNA saiz tertentu, walau bagaimanapun, kaedah ini mempunyai beberapa kelemahan, seperti masa elektroforesis yang agak panjang dan keputusan yang kurang tepat untuk nilai kritikal.

Oleh itu, dalam 2013, Beliau Zhangyong et al. ^[1] digunakan untuk mengkaji kesan kepekatan polietilena glikol yang berbeza (PEG) mengenai pemulihan serpihan DNA dengan kehadiran 1 μm manik magnet berkarboksilasi pada kepekatan tetap natrium klorida (NaCl). Mereka juga memasangkan kepekatan mereka kepada kepekatan PEG dengan fungsi logistik dan menentukan nilai PEG kritikal daripada fungsi logistik yang dipasang.. Atas dasar ini, mereka memperoleh fungsi cerun persamaan pemulihan dengan memperoleh terbitan tertib pertama dan menggunakan fungsi cerun berdasarkan parameter ini untuk membina spektrum pemulihan serpihan DNA yang dapat menentukan kepekatan NaCl dan PEG untuk pengasingan serpihan yang berbeza. ^[2]. Sebagai tambahan kepada ini, mereka mendapati dalam kajian mereka bahawa pH tidak mempunyai kesan ke atas keberkesanan sistem mereka dan bahawa saiz berat molekul PEG adalah berkadar songsang dengan saiz kepekatan yang diperlukan.

Manakala sebelum ini E. Froehlich et al ^[3] menyiasat pengikatan DNA kepada polietilena glikol (PEG) dengan saiz dan komposisi yang berbeza (cth., PEG 3350, PEG 6000, dan MPEG-antrasena) dalam larutan garam-ion. Analisis struktur menunjukkan bahawa PEG 3350 dan PEG 6000 membentuk kompleks sederhana, manakala bahan tambah mPEG-antrasena-DNA mempunyai interaksi yang lemah dengan kumpulan hidrofilik dan hidrofobik yang bersentuhan. Kestabilan kompleks yang terbentuk adalah mengikut susunan PEG 6000 > PEG 3350 > mPEG-antrasena, dengan hampir satu molekul PEG terikat setiap DNA. Tiada perubahan konformasi diperhatikan untuk B-DNA, manakala pada kepekatan PEG yang lebih tinggi, DNA memekatkan dan membentuk zarah.

Selain itu, Lingling Liu et al^[2] menunjukkan bahawa zarah silika lisin boleh digunakan untuk pemisahan saiz-pilihan bagi campuran DNA binari dan terner dengan melaraskan interaksi elektrostatik antara serpihan DNA dan permukaan zarah silika yang berfungsi lisin mengikut pH ambien., khususnya, kekuatan ion. Pertuduhan serpihan DNA, dan interaksi elektrostatik antara mereka dan permukaan zarah silika bercas bertentangan, ditentukan oleh pH persekitaran. Caj serpihan DNA dan interaksi elektrostatiknya dengan permukaan zarah silika bercas bertentangan berkait rapat dengan saiz serpihan DNA., dan mekanisme pemisahan terpilih serpihan DNA menggunakan zarah Lys-SiO2 ditunjukkan dalam Rajah 1.

Dalam 2020 Alexei et al ^[4] mengalihkan selang pengasingan terpilih serpihan DNA daripada 150-800 bp kepada 1.5-7 Kbp dengan melaraskan kepekatan NaCl dalam penimbal manik magnetik. Apabila menggantikan NaCl dengan kation lain dan menurunkan kepekatan polietilenaglikol (PEG) 8000, selang serpihan DNA yang dipisahkan secara terpilih berbeza-beza, dengan LiCl yang paling berkesan di sini.

2023 Danli et al ^[5] menguji pemulihan maksimum kepekatan kritikal polietilena glikol (PEG) 8000 dan 300 manik magnet berkarboksilasi nm, menentukan komposisi penimbal manik magnet untuk manik magnet berkarboksilasi daripada 20% PEG 8000, 2M NaCl, dan 16.3 mM MgCl2, bersama-sama dengan 1.25 mg/ml manik magnet. Mereka kemudian menguji protokol untuk pemulihan DNA yang setanding dengan kawalan Beckman (Manik magnet AMPure XP).

Reserve buffers are not universal due to the different parameters of different types of magnetic beads. Namun begitu, any researcher can further optimize the magnetic bead suspension buffer based on known data results for efficient recovery or for different experimental purposes. From standard commercial DNA purification methods to adjusting SPRI bead concentrations and optimal bead suspension buffers, this can provide researchers with a great deal of flexibility and convenience for different DNA manipulation conditions. Selain itu, different DNA purification strategies have great potential for application in the biological and medical fields.

Reference：

[1] HE Z, ZHU Y, GU H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments[J/OL]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(20): 9175-9183. DOI:10.1007/s00253-013-5195-0.

[2] HE Z, XU H, XIONG M, et al. Size‐selective DNA separation: Recovery spectra help determine the sodium chloride (NaCl) dan polietilena glikol (PEG) concentrations required[J/OL]. Biotechnology Journal, 2014, 9(10): 1241-1249. DOI:10.1002/biot.201400234.

[3] PEG and mPEG–Anthracene Induce DNA Condensation and Particle Formation | The Journal of Physical Chemistry B[EB/OL]. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp205079u.

[4] STORTCHEVOI A, KAMELAMELA N, LEVINE S S. SPRI Beads-based Size Selection in the Range of 2-10kb[J/OL]. Journal of Biomolecular Techniques : JBT, 2020, 31(1): 7-10. DOI:10.7171/jbt.20-3101-002.

[5] LIU D, LIQ, LUO J, et al. Strategi penulenan DNA berasaskan manik SPRI untuk fleksibiliti dan keberkesanan kos[J/OL]. BMC Genomics, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

Pembekal

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.ditubuhkan pada 2016 yang merupakan pengilang profesional bahan biomagnet dan reagen pengekstrakan asid nukleik.

Kami mempunyai pengalaman yang kaya dalam pengekstrakan dan penulenan asid nukleik, penulenan protein, pemisahan sel, chemiluminescence, dan bidang teknikal yang lain.

Produk kami digunakan secara meluas dalam pelbagai bidang, seperti ujian perubatan, ujian genetik, penyelidikan universiti, pembiakan genetik, dan seterusnya. Kami bukan sahaja menyediakan produk tetapi juga boleh menjalankan OEM, ODM, dan keperluan lain. Jika anda mempunyai keperluan yang berkaitan, sila hubungi kami disales01@lingjunbio.com.