Investigación y avances en la clasificación de fragmentos de ADN

Inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) Se han utilizado técnicas para el aislamiento de ADN durante el pasado. 20 años. en eso, Las perlas magnéticas carboxiladas superparamagnéticas se utilizan para precipitar selectivamente moléculas de ADN de diferentes tamaños en condiciones de polietilenglicol. (CLAVIJA) porcentaje y concentración de sal, y los productos obtenidos se pueden utilizar para preparar bibliotecas de muestras NGS. Uno de los puntos clave del método es la determinación del valor crítico de PEG ya que este es el parámetro más importante para la separación selectiva de fragmentos de ADN..

Estudios anteriores han encontrado que el aislamiento selectivo de fragmentos de ADN está asociado con un cambio conformacional en la morfología del ADN de enrollado a globular.. Previamente, Los investigadores han utilizado una variedad de métodos para determinar la concentración crítica de PEG que induce la transición de las moléculas de ADN de enrolladas a esféricas., como la sedimentación, imágenes de fluorescencia, viscosidad, Centrifugación UV/Vis, y dispersión dinámica de la luz (DLS), y dicroísmo circular. Sin embargo, Estos métodos no se aplicaron a soluciones de ADN que contenían perlas magnéticas porque las moléculas globulares de ADN precipitarían sobre superficies sólidas.. Por lo tanto, Posteriormente, investigadores han utilizado electroforesis en gel para determinar la concentración crítica de PEG para fragmentos de ADN de un tamaño específico., sin embargo, este método tiene varias desventajas, como el tiempo de electroforesis relativamente largo y resultados menos precisos para valores críticos.

Por lo tanto, en 2013, Él Zhangyong et al. ^[1] utilizado para estudiar el efecto de diferentes concentraciones de polietilenglicol (CLAVIJA) sobre la recuperación de fragmentos de ADN en presencia de 1 Perlas magnéticas carboxiladas de μm a una concentración fija de cloruro de sodio (NaCl). También ajustaron sus concentraciones a la concentración de PEG mediante una función logística y determinaron el valor crítico de PEG a partir de la función logística ajustada.. Sobre esta base, obtuvieron la función de pendiente de la ecuación de recuperación derivando sus derivadas de primer orden y utilizaron la función de pendiente basada en estos parámetros para construir un espectro de recuperación de fragmentos de ADN que pudo determinar la concentración de NaCl y PEG para la separación de diferentes fragmentos. ^[2]. Además de esto, En su estudio descubrieron que el pH no tiene ningún efecto sobre la eficacia de su sistema y que el tamaño del peso molecular del PEG es inversamente proporcional al tamaño de la concentración requerida..

Mientras que antes E. Froehlich et al. ^[3] investigó la unión del ADN a los polietilenglicoles (CLAVIJA) de diferentes tamaños y composiciones (p.ej., CLAVIJA 3350, CLAVIJA 6000, y MPEG-antraceno) en soluciones sal-iónicas. El análisis estructural mostró que PEG 3350 y clavija 6000 formó complejos moderados, mientras que los aductos de mPEG-antraceno-ADN tuvieron interacciones débiles con grupos hidrófilos e hidrófobos en contacto. La estabilidad de los complejos formados fue del orden de PEG. 6000 > CLAVIJA 3350 > mPEG-antraceno, con casi una molécula de PEG unida por ADN. No se observaron cambios conformacionales para el ADN B., mientras que a concentraciones más altas de PEG el ADN se condensó y formó partículas.

Además, Lingling Liu y otros^[2] demostró que las partículas de sílice de lisina podrían usarse para la separación selectiva por tamaño de mezclas de ADN binarias y ternarias ajustando las interacciones electrostáticas entre los fragmentos de ADN y la superficie de las partículas de sílice funcionalizadas con lisina de acuerdo con el pH ambiental, En particular, la fuerza iónica. La carga de los fragmentos de ADN., y las interacciones electrostáticas entre ellos y la superficie de partículas de sílice con carga opuesta, fue determinado por el pH del ambiente. La carga de los fragmentos de ADN y sus interacciones electrostáticas con la superficie de las partículas de sílice con carga opuesta están estrechamente relacionadas con el tamaño de los fragmentos de ADN., y el mecanismo de separación selectiva de fragmentos de ADN utilizando partículas de Lys-SiO2 se muestra en la Figura 1.

En 2020 Alexei y otros ^[4] cambió el intervalo de aislamiento selectivo de fragmentos de ADN de 150-800 pb a 1.5-7 Kbp ajustando la concentración de NaCl en el tampón de perlas magnéticas. Al reemplazar NaCl con otros cationes y reducir la concentración de polietilenglicol. (CLAVIJA) 8000, los intervalos de los fragmentos de ADN separados selectivamente variaron, siendo LiCl el más efectivo aquí.

2023 Danlí y otros ^[5] probó la recuperación maximizada de concentraciones críticas de polietilenglicol (CLAVIJA) 8000 y 300 nm perlas magnéticas carboxiladas, determinar una composición tampón de perlas magnéticas para perlas magnéticas carboxiladas de 20% CLAVIJA 8000, 2NaCl, y 16.3 MgCl2 mM, junto con 1.25 perlas magnéticas mg/ml. Luego probaron el protocolo para la recuperación de ADN comparable a un Beckman de control. (Perlas magnéticas AMPure XP).

Los amortiguadores de reserva no son universales debido a los diferentes parámetros de los diferentes tipos de perlas magnéticas.. Sin embargo, cualquier investigador puede optimizar aún más el tampón de suspensión de perlas magnéticas basándose en resultados de datos conocidos para una recuperación eficiente o para diferentes propósitos experimentales.. Desde métodos comerciales estándar de purificación de ADN hasta el ajuste de concentraciones de perlas SPRI y tampones de suspensión de perlas óptimos, Esto puede proporcionar a los investigadores una gran flexibilidad y comodidad para diferentes condiciones de manipulación del ADN.. Además, Diferentes estrategias de purificación de ADN tienen un gran potencial de aplicación en los campos biológico y médico..

Referencia：

[1] ÉL Z, ZHU Y, A H. Un nuevo método para la determinación de la concentración crítica de polietilenglicol para la precipitación selectiva de fragmentos de ADN.[J/OL]. Microbiología Aplicada y Biotecnología, 2013, 97(20): 9175-9183. DOI:10.1007/s00253-013-5195-0.

[2] ÉL Z, XUH, XIONG M, et al. Separación de ADN selectiva por tamaño: Los espectros de recuperación ayudan a determinar el cloruro de sodio. (NaCl) y polietilenglicol (CLAVIJA) concentraciones requeridas[J/OL]. Revista de biotecnología, 2014, 9(10): 1241-1249. DOI:10.1002/biot.201400234.

[3] PEG y mPEG-antraceno inducen la condensación del ADN y la formación de partículas | La Revista de Química Física B[EB/OL]. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp205079u.

[4] STORCHEVOI A, KAMELA N., LEVINE S S. Selección de tamaño basada en perlas SPRI en el rango de 2 a 10 kb[J/OL]. Revista de técnicas biomoleculares : JBT, 2020, 31(1): 7-10. DOI:10.7171/etc 20-3101-002.

[5] LIU D, LIQ, LUO J., et al. Una estrategia de purificación de ADN basada en perlas SPRI para mayor flexibilidad y rentabilidad[J/OL]. Genómica BMC, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

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