Forschung und Fortschritte bei der Sortierung von DNA-Fragmenten

Reversible Festphasenimmobilisierung (SPRI) Für die DNA-Isolierung wurden in der Vergangenheit Techniken eingesetzt 20 Jahre. Darin, Superparamagnetische carboxylierte Magnetkügelchen werden verwendet, um DNA-Moleküle unterschiedlicher Größe unter Bedingungen von Polyethylenglykol selektiv auszufällen (PFLOCK) Prozentsatz und Salzkonzentration, und die erhaltenen Produkte können zur Erstellung von NGS-Beispielbibliotheken verwendet werden. Einer der Kernpunkte der Methode ist die Bestimmung des kritischen PEG-Wertes, da dieser der wichtigste Parameter für die selektive Trennung von DNA-Fragmenten ist.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die selektive Isolierung von DNA-Fragmenten mit einer Konformationsverschiebung der DNA-Morphologie von Coiled-Coil zu Kugel verbunden ist. Vorher, Forscher haben verschiedene Methoden verwendet, um die kritische PEG-Konzentration zu bestimmen, die den Übergang von DNA-Molekülen von der Spirale zur Kugelform induziert, wie Sedimentation, Fluoreszenzbildgebung, Viskosität, UV/Vis-Zentrifugation, und dynamische Lichtstreuung (DLS), und Zirkulardichroismus. Jedoch, Diese Methoden waren nicht auf DNA-Lösungen anwendbar, die Magnetkügelchen enthielten, da die kugelförmigen DNA-Moleküle auf festen Oberflächen ausfallen würden. daher, spätere Forscher nutzten die Gelelektrophorese, um die kritische PEG-Konzentration für DNA-Fragmente einer bestimmten Größe zu bestimmen, Jedoch, Diese Methode hat mehrere Nachteile, wie die relativ lange Elektrophoresezeit und weniger genaue Ergebnisse für kritische Werte.

daher, In 2013, He Zhangyong et al. ^[1] Wird verwendet, um die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen von Polyethylenglykol zu untersuchen (PFLOCK) zur Gewinnung von DNA-Fragmenten in Gegenwart von 1 μm carboxylierte Magnetkügelchen bei einer festen Natriumchloridkonzentration (NaCl). Außerdem passten sie ihre Konzentrationen mithilfe einer logistischen Funktion an die PEG-Konzentration an und ermittelten den kritischen PEG-Wert anhand der angepassten logistischen Funktion. Auf dieser Basis, Sie erhielten die Steigungsfunktion der Wiederherstellungsgleichung durch Ableitung ihrer Ableitungen erster Ordnung und verwendeten die Steigungsfunktion basierend auf diesen Parametern, um ein DNA-Fragment-Rückgewinnungsspektrum zu erstellen, mit dem die Konzentration von NaCl und PEG für die Trennung verschiedener Fragmente bestimmt werden konnte ^[2]. Darüber hinaus, Sie fanden in ihrer Studie heraus, dass der pH-Wert keinen Einfluss auf die Wirksamkeit ihres Systems hat und dass die Molekulargewichtsgröße von PEG umgekehrt proportional zur Größe der erforderlichen Konzentration ist.

Während früher E. Fröhlich et al ^[3] untersuchte die Bindung von DNA an Polyethylenglykole (PFLOCK) unterschiedlicher Größe und Zusammensetzung (z.B., PFLOCK 3350, PFLOCK 6000, und MPEG-Anthracen) in salzionischen Lösungen. Die Strukturanalyse zeigte, dass PEG 3350 und PEG 6000 bildete moderate Komplexe, wohingegen die mPEG-Anthracen-DNA-Addukte schwache Wechselwirkungen mit hydrophilen und hydrophoben Gruppen in Kontakt hatten. Die Stabilität der gebildeten Komplexe lag in der Größenordnung von PEG 6000 > PFLOCK 3350 > mPEG-Anthracen, wobei pro DNA fast ein PEG-Molekül gebunden ist. Für B-DNA wurden keine Konformationsänderungen beobachtet, wohingegen bei höheren PEG-Konzentrationen die DNA kondensierte und Partikel bildete.

Zusätzlich, Lingling Liu et al^[2] zeigten, dass Lysin-Silica-Partikel zur größenselektiven Trennung von binären und ternären DNA-Gemischen verwendet werden können, indem die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen DNA-Fragmenten und der Oberfläche von Lysin-funktionalisierten Silica-Partikeln entsprechend dem pH-Wert der Umgebung angepasst werden, insbesondere, die Ionenstärke. Die Ladung der DNA-Fragmente, und die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen ihnen und der Oberfläche entgegengesetzt geladener Siliciumdioxidpartikel, wurde durch den pH-Wert der Umgebung bestimmt. Die Ladung von DNA-Fragmenten und ihre elektrostatischen Wechselwirkungen mit der Oberfläche der entgegengesetzt geladenen Silica-Partikel hängen eng mit der Größe der DNA-Fragmente zusammen, und der Mechanismus der selektiven Trennung von DNA-Fragmenten mithilfe von Lys-SiO2-Partikeln ist in Abbildung dargestellt 1.

In 2020 Alexei et al ^[4] Das Intervall der selektiven Isolierung von DNA-Fragmenten wurde verschoben 150-800 bp zu 1.5-7 Kbp durch Anpassen der NaCl-Konzentration im magnetischen Bead-Puffer. Beim Ersetzen von NaCl durch andere Kationen und Senken der Konzentration von Polyethylenglykol (PFLOCK) 8000, die selektiv getrennten DNA-Fragmentintervalle variierten, wobei LiCl hier am effektivsten ist.

2023 Danli et al ^[5] testete die maximale Rückgewinnung kritischer Konzentrationen von Polyethylenglykol (PFLOCK) 8000 Und 300 nm carboxylierte Magnetkügelchen, Bestimmen einer magnetischen Bead-Pufferzusammensetzung für carboxylierte magnetische Beads von 20% PFLOCK 8000, 2M NaCl, Und 16.3 mM MgCl2, zusammen mit 1.25 mg/ml Magnetkügelchen. Anschließend testeten sie das Protokoll zur DNA-Gewinnung, vergleichbar mit einem Kontroll-Beckman (AMPure XP Magnetperlen).

Reservepuffer sind aufgrund der unterschiedlichen Parameter verschiedener Arten von Magnetkügelchen nicht universell einsetzbar. Jedoch, Jeder Forscher kann den Magnetkügelchen-Suspensionspuffer basierend auf bekannten Datenergebnissen für eine effiziente Rückgewinnung oder für verschiedene experimentelle Zwecke weiter optimieren. Von standardmäßigen kommerziellen DNA-Reinigungsmethoden bis hin zur Anpassung der SPRI-Bead-Konzentrationen und optimalen Bead-Suspensionspuffern, Dies kann Forschern ein hohes Maß an Flexibilität und Komfort für verschiedene DNA-Manipulationsbedingungen bieten. Zusätzlich, Verschiedene DNA-Reinigungsstrategien haben großes Potenzial für die Anwendung im biologischen und medizinischen Bereich.

Referenz：

[1] HE Z, ZHU Y, ZU H. Eine neue Methode zur Bestimmung der kritischen Polyethylenglykolkonzentration zur selektiven Fällung von DNA-Fragmenten[J/OL]. Angewandte Mikrobiologie und Biotechnologie, 2013, 97(20): 9175-9183. DOI:10.1007/s00253-013-5195-0.

[2] HE Z, XU H, XIONG M, et al. Größenselektive DNA-Trennung: Erholungsspektren helfen bei der Bestimmung des Natriumchlorids (NaCl) und Polyethylenglykol (PFLOCK) Konzentrationen erforderlich[J/OL]. Biotechnologie-Journal, 2014, 9(10): 1241-1249. DOI:10.1002/biot.201400234.

[3] PEG und mPEG-Anthracen induzieren DNA-Kondensation und Partikelbildung | Das Journal of Physical Chemistry B[EB/OL]. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp205079u.

[4] STORTCHEVOI A, KAMELA N, LEVINE S S. SPRI-Perlen-basierte Größenauswahl im Bereich von 2–10 KB[J/OL]. Zeitschrift für biomolekulare Techniken : JBT, 2020, 31(1): 7-10. DOI:10.7171/usw. 20-3101-002.

[5] LIU D, LIQ, LUO J, et al. Eine auf SPRI-Kügelchen basierende DNA-Reinigungsstrategie für Flexibilität und Kosteneffizienz[J/OL]. BMC-Genomik, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

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