Forskning og fremskritt innen sortering av DNA-fragmenter

Fastfase reversibel immobilisering (SPRI) teknikker har blitt brukt for DNA-isolering tidligere 20 år. I den, superparamagnetiske karboksylerte magnetiske perler brukes til å selektivt utfelle DNA-molekyler av forskjellige størrelser under forhold med polyetylenglykol (KNAGG) prosent og saltkonsentrasjon, og de oppnådde produktene kan brukes til å forberede NGS-prøvebibliotek. Et av hovedpunktene i metoden er bestemmelsen av den kritiske PEG-verdien siden dette er den viktigste parameteren for selektiv separasjon av DNA-fragmenter.

Tidligere studier har funnet at selektiv isolering av DNA-fragmenter er assosiert med et konformasjonsskifte i DNA-morfologi fra coil-coil til kuleformet. Tidligere, forskere har brukt en rekke metoder for å bestemme den kritiske PEG-konsentrasjonen som induserer overgangen til DNA-molekyler fra kveilet til sfærisk, som sedimentering, fluorescensavbildning, viskositet, UV/Vis sentrifugering, og dynamisk lysspredning (DLS), og sirkulær dikroisme. Imidlertid, disse metodene gjaldt ikke DNA-løsninger som inneholder magnetiske perler fordi de kuleformede DNA-molekylene ville utfelles på faste overflater. Derfor, senere forskere har brukt gelelektroforese for å bestemme den kritiske PEG-konsentrasjonen for DNA-fragmenter av en bestemt størrelse, imidlertid, denne metoden har flere ulemper, slik som den relativt lange elektroforesetiden og mindre nøyaktige resultater for kritiske verdier.

Derfor, i 2013, Han Zhangyong et al. ^[1] brukes til å studere effekten av ulike konsentrasjoner av polyetylenglykol (KNAGG) på gjenvinning av DNA-fragmenter i nærvær av 1 μm karboksylerte magnetiske perler ved en fast konsentrasjon av natriumklorid (NaCl). De tilpasset også konsentrasjonene til PEG-konsentrasjonen ved hjelp av en logistikkfunksjon og bestemte den kritiske PEG-verdien fra den tilpassede logistikkfunksjonen. På dette grunnlaget, de oppnådde helningsfunksjonen til utvinningsligningen ved å utlede dens førsteordens derivater og brukte helningsfunksjonen basert på disse parameterne for å bygge et DNA-fragmentgjenvinningsspektrum som var i stand til å bestemme konsentrasjonen av NaCl og PEG for separasjon av forskjellige fragmenter ^[2]. I tillegg til dette, de fant i sin studie at pH ikke har noen effekt på effektiviteten til systemet deres, og at molekylvektstørrelsen til PEG er omvendt proporsjonal med størrelsen på konsentrasjonen som kreves.

Mens tidligere E. Froehlich et al ^[3] undersøkte bindingen av DNA til polyetylenglykoler (KNAGG) av forskjellige størrelser og sammensetninger (f.eks., KNAGG 3350, KNAGG 6000, og MPEG-antracen) i saltioniske løsninger. Strukturanalyse viste at PEG 3350 og PEG 6000 dannet moderate komplekser, mens mPEG-antracen-DNA-adduktene hadde svake interaksjoner med hydrofile og hydrofobe grupper i kontakt. Stabiliteten til de dannede kompleksene var i størrelsesorden PEG 6000 > KNAGG 3350 > mPEG-antracen, med nesten ett PEG-molekyl bundet per DNA. Ingen konformasjonsendringer ble observert for B-DNA, mens ved høyere PEG-konsentrasjoner kondenserte DNA og dannet partikler.

I tillegg, Lingling Liu et al^[2] demonstrert at lysin-silika-partikler kunne brukes til størrelseselektiv separasjon av binære og ternære DNA-blandinger ved å justere de elektrostatiske interaksjonene mellom DNA-fragmenter og overflaten av lysin-funksjonaliserte silika-partikler i henhold til omgivelses pH, spesielt, ionestyrken. Ladningen til DNA-fragmentene, og de elektrostatiske interaksjonene mellom dem og overflaten av motsatt ladede silikapartikler, ble bestemt av pH i miljøet. Ladningen av DNA-fragmenter og deres elektrostatiske interaksjoner med overflaten av de motsatt ladede silikapartiklene er nært knyttet til størrelsen på DNA-fragmentene, og mekanismen for selektiv separasjon av DNA-fragmenter ved bruk av Lys-SiO2-partikler er vist i figur 1.

I 2020 Alexei et al ^[4] forskjøvet intervallet for selektiv isolering av DNA-fragmenter av 150-800 bp til 1.5-7 Kbp ved å justere konsentrasjonen av NaCl i den magnetiske perlebufferen. Når du erstatter NaCl med andre kationer og senker konsentrasjonen av polyetylenglykol (KNAGG) 8000, de selektivt separerte DNA-fragmentintervallene varierte, med LiCl som den mest effektive her.

2023 Danli et al ^[5] testet den maksimerte gjenvinningen av kritiske konsentrasjoner av polyetylenglykol (KNAGG) 8000 og 300 nm karboksylerte magnetiske perler, bestemme en magnetisk perlebuffersammensetning for karboksylerte magnetiske perler av 20% KNAGG 8000, 2M NaCl, og 16.3 mM MgCl2, sammen med 1.25 mg/ml magnetiske perler. De testet deretter protokollen for DNA-gjenoppretting som kan sammenlignes med en kontroll Beckman (AMPure XP magnetiske perler).

Reservebuffere er ikke universelle på grunn av de forskjellige parameterne til forskjellige typer magnetiske perler. Imidlertid, enhver forsker kan videre optimalisere den magnetiske perlesuspensjonsbufferen basert på kjente dataresultater for effektiv gjenoppretting eller for forskjellige eksperimentelle formål. Fra standard kommersielle DNA-rensemetoder til justering av SPRI-kulekonsentrasjoner og optimale kulesuspensjonsbuffere, dette kan gi forskerne en stor grad av fleksibilitet og bekvemmelighet for ulike DNA-manipulasjonsforhold. I tillegg, ulike DNA-rensestrategier har stort potensiale for anvendelse innen biologiske og medisinske felt.

Referanse：

[1] HE Z, ZHU Y, TIL H. En ny metode for bestemmelse av kritisk polyetylenglykolkonsentrasjon for selektiv utfelling av DNA-fragmenter[J/OL]. Anvendt mikrobiologi og bioteknologi, 2013, 97(20): 9175-9183. DOI:10.1007/s00253-013-5195-0.

[2] HE Z, XU H, XIONG M, et al. Størrelseselektiv DNA-separasjon: Utvinningsspektra hjelper til med å bestemme natriumkloridet (NaCl) og polyetylenglykol (KNAGG) nødvendige konsentrasjoner[J/OL]. Bioteknologisk tidsskrift, 2014, 9(10): 1241-1249. DOI:10.1002/biot.201400234.

[3] PEG og mPEG–antracen induserer DNA-kondensasjon og partikkeldannelse | Journal of Physical Chemistry B[EB/OL]. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp205079u.

[4] STORTCHEVOI A, KAMELA N, LEVINE S S. SPRI Beads-basert størrelsesvalg i området 2-10kb[J/OL]. Journal of Biomolecular Techniques : JBT, 2020, 31(1): 7-10. DOI:10.7171/etc. 20-3101-002.

[5] LIU D, LIQ, LUO J, et al. En SPRI-perlebasert DNA-rensestrategi for fleksibilitet og kostnadseffektivitet[J/OL]. BMC Genomics, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.ble etablert i 2016 som er en profesjonell produsent av biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraksjonsreagenser.

Vi har rik erfaring innen utvinning og rensing av nukleinsyre, proteinrensing, celleseparasjon, kjemiluminescens, og andre tekniske felt.

Våre produkter er mye brukt på mange felt, som medisinsk testing, genetisk testing, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke bare produkter, men kan også påta oss OEM, ODM, og andre behov. Hvis du har et relatert behov, ta gjerne kontakt med oss ​​påsales01@lingjunbio.com.