Pesquisa e avanços na classificação de fragmentos de DNA

Imobilização reversível em fase sólida (SPRI) técnicas têm sido usadas para isolamento de DNA no passado 20 anos. Nele, esferas magnéticas carboxiladas superparamagnéticas são usadas para precipitar seletivamente moléculas de DNA de diferentes tamanhos sob condições de polietilenoglicol (PEG) porcentagem e concentração de sal, e os produtos obtidos podem ser usados ​​para preparar bibliotecas de amostras NGS. Um dos pontos-chave do método é a determinação do valor crítico de PEG, uma vez que este é o parâmetro mais importante para a separação seletiva de fragmentos de DNA..

Estudos anteriores descobriram que o isolamento seletivo de fragmentos de DNA está associado a uma mudança conformacional na morfologia do DNA de espiral enrolada para globular.. Anteriormente, os pesquisadores usaram uma variedade de métodos para determinar a concentração crítica de PEG que induz a transição das moléculas de DNA de enroladas para esféricas, como sedimentação, imagem de fluorescência, viscosidade, Centrifugação UV/Vis, e dispersão dinâmica de luz (DLS), e dicroísmo circular. No entanto, esses métodos não se aplicavam a soluções de DNA contendo esferas magnéticas porque as moléculas globulares de DNA precipitariam em superfícies sólidas. Portanto, pesquisadores posteriores usaram eletroforese em gel para determinar a concentração crítica de PEG para fragmentos de DNA de um tamanho específico, no entanto, este método tem várias desvantagens, como o tempo de eletroforese relativamente longo e resultados menos precisos para valores críticos.

Portanto, em 2013, Ele Zhangyong et al. ^[1] usado para estudar o efeito de diferentes concentrações de polietilenoglicol (PEG) na recuperação de fragmentos de DNA na presença de 1 μm esferas magnéticas carboxiladas em uma concentração fixa de cloreto de sódio (NaCl). Eles também ajustaram suas concentrações à concentração de PEG por uma função logística e determinaram o valor crítico de PEG a partir da função logística ajustada. Nesta base, eles obtiveram a função de inclinação da equação de recuperação derivando suas derivadas de primeira ordem e usaram a função de inclinação com base nesses parâmetros para construir um espectro de recuperação de fragmentos de DNA que foi capaz de determinar a concentração de NaCl e PEG para a separação de diferentes fragmentos ^[2]. Além disso, eles descobriram em seu estudo que o pH não tem efeito na eficácia do seu sistema e que o tamanho do peso molecular do PEG é inversamente proporcional ao tamanho da concentração necessária.

Enquanto o anterior E. Froehlich et al ^[3] investigou a ligação do DNA aos polietilenoglicóis (PEG) de diferentes tamanhos e composições (por exemplo, PEG 3350, PEG 6000, e MPEG-antraceno) em soluções sal-iônicas. A análise estrutural mostrou que o PEG 3350 e PEG 6000 formou complexos moderados, enquanto os adutos mPEG-antraceno-DNA tiveram interações fracas com grupos hidrofílicos e hidrofóbicos em contato. A estabilidade dos complexos formados foi da ordem de PEG 6000 > PEG 3350 > mPEG-antraceno, com quase uma molécula de PEG ligada por DNA. Nenhuma mudança conformacional foi observada para B-DNA, enquanto em concentrações mais altas de PEG o DNA condensou e formou partículas.

Além disso, Lingling Liu et al.^[2] demonstraram que partículas de sílica lisina poderiam ser usadas para separação seletiva de tamanho de misturas binárias e ternárias de DNA, ajustando as interações eletrostáticas entre fragmentos de DNA e a superfície de partículas de sílica funcionalizadas com lisina de acordo com o pH ambiente, em particular, a força iônica. A carga dos fragmentos de DNA, e as interações eletrostáticas entre eles e a superfície de partículas de sílica com carga oposta, foi determinado pelo pH do ambiente. A carga dos fragmentos de DNA e suas interações eletrostáticas com a superfície das partículas de sílica com carga oposta estão intimamente relacionadas ao tamanho dos fragmentos de DNA., e o mecanismo de separação seletiva de fragmentos de DNA usando partículas Lys-SiO2 é mostrado na Figura 1.

Em 2020 Alexei e outros ^[4] mudou o intervalo de isolamento seletivo de fragmentos de DNA de 150-800 bp para 1.5-7 Kbp ajustando a concentração de NaCl no tampão de esfera magnética. Ao substituir o NaCl por outros cátions e diminuir a concentração de polietilenoglicol (PEG) 8000, os intervalos dos fragmentos de DNA separados seletivamente variaram, com LiCl sendo o mais eficaz aqui.

2023 Danli et al ^[5] testou a recuperação maximizada de concentrações críticas de polietilenoglicol (PEG) 8000 e 300 grânulos magnéticos carboxilados nm, determinação de uma composição tampão de esfera magnética para esferas magnéticas carboxiladas de 20% PEG 8000, 2M NaCl, e 16.3 mM MgCl2, juntamente com 1.25 mg/ml esferas magnéticas. Eles então testaram o protocolo para recuperação de DNA comparável a um controle Beckman (Esferas magnéticas AMPure XP).

Os buffers de reserva não são universais devido aos diferentes parâmetros dos diferentes tipos de esferas magnéticas. No entanto, qualquer pesquisador pode otimizar ainda mais o buffer de suspensão de esferas magnéticas com base em resultados de dados conhecidos para recuperação eficiente ou para diferentes fins experimentais. Desde métodos comerciais padrão de purificação de DNA até o ajuste das concentrações de esferas SPRI e tampões ideais de suspensão de esferas, isso pode fornecer aos pesquisadores muita flexibilidade e conveniência para diferentes condições de manipulação de DNA. Além disso, diferentes estratégias de purificação de DNA têm grande potencial para aplicação nas áreas biológica e médica.

Referência：

[1] ELE Z, ZHUY, PARA H. Um novo método para determinação da concentração crítica de polietilenoglicol para precipitação seletiva de fragmentos de DNA[J/OL]. Microbiologia Aplicada e Biotecnologia, 2013, 97(20): 9175-9183. DOI:10.1007/s00253-013-5195-0.

[2] ELE Z, XU H, XIONG M, e outros. Separação de DNA seletiva por tamanho: Os espectros de recuperação ajudam a determinar o cloreto de sódio (NaCl) e polietilenoglicol (PEG) concentrações necessárias[J/OL]. Revista de Biotecnologia, 2014, 9(10): 1241-1249. DOI:10.1002/biot.201400234.

[3] PEG e mPEG-Antraceno induzem condensação de DNA e formação de partículas | O Jornal de Química Física B[EB/OL]. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp205079u.

[4] STORCHEVOI A, CAMELA N, LEVINE S S. Seleção de tamanho baseada em contas SPRI na faixa de 2 a 10kb[J/OL]. Jornal de Técnicas Biomoleculares : JBT, 2020, 31(1): 7-10. DOI:10.7171/etc. 20-3101-002.

[5] LIU D, LIQ, LUO J., e outros. Uma estratégia de purificação de DNA baseada em esferas SPRI para flexibilidade e economia[J/OL]. Genômica BMC, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

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