Por que o ajuste do pH é necessário na extração de DNA?

O pH é muito importante na extração de DNA e as razões são as seguintes:

1. Mantendo a estabilidade do DNA

O DNA permanece relativamente estável em soluções com pH maior que 5 e menos de 9. Quando o pH está excessivamente alto (por exemplo, acima 12) ou baixo (por exemplo, abaixo 3), as ligações de hidrogênio entre as fitas duplas do DNA se dissociarão, levando à desnaturação do DNA. Por exemplo, O tampão II contém 0.2 M NaOH na extração de DNA plasmídico, resultando em um pH do sistema de 12. 6, que induz a desnaturação do DNA cromossômico e plasmidial. Consequentemente, é necessário ajustar o pH de volta à neutralidade nas etapas subsequentes. Isso serve a dois propósitos: primeiro, permite que o DNA plasmídico desnaturado se renature e permaneça estável; segundo, aproveita a diferença no tamanho do fragmento entre o DNA genômico e o DNA plasmidial (com plasmídeos sendo menores e mais propensos a recozimento em dsDNA, enquanto gDNA, sendo muito longo, não pode recozir totalmente e, em vez disso, fica emaranhado, precipitando com complexos de proteína SDS sob a influência de altas concentrações de sal no tampão III).

2. Prevenindo a degradação do DNA

 O EDTA pode se ligar a íons metálicos como Mg²⁺e Ca²⁺presentes na solução. Esses íons metálicos são cofatores para DNase. EDTA inibe a atividade da DNase, evitando assim a degradação do DNA ao quelar esses íons metálicos.

3. Otimizando a eficiência da extração

A pesquisa mostrou que o pH ideal para extração de DNA é 7,4. O rendimento da extração de DNA é maximizado quando o tampão com pH 7. 4. Quanto mais o pH se desvia deste valor, menor será o rendimento de extração de DNA. Por exemplo, o rendimento de extração de DNA em pH 7.4 é 1.09, 1.03, 1.06, e 1.11 vezes isso em pH 7,2, 7.6, 7.8, e 8.0, respectivamente.

Facilitando a ligação do ácido nucleico às esferas magnéticas: Um pH apropriado pode promover a ligação de ácidos nucleicos a esferas magnéticas em métodos de extração de DNA baseados em esferas magnéticas. Um tampão de ligação com alto teor de sal pode neutralizar as cargas negativas dos ácidos nucléicos, reduzindo a repulsão eletrostática entre ácidos nucleicos e esferas magnéticas, facilitando assim a adsorção de ácidos nucleicos na superfície das esferas.

4. Protegendo a atividade da lisozima

A lisozima é utilizada durante a extração de DNA plasmídico de bactérias Gram-positivas. A lisozima é uma glicosídeo hidrolase que pode hidrolisar o β-1, 4 ligações glicosídicas em peptidoglicano, o principal componente químico da parede celular de G⁺ bactérias, exercendo assim um efeito lítico. A atividade da lisozima é inibida quando o pH do tampão é inferior a 8. Portanto, é essencial manter um pH adequado para garantir a atividade da lisozima.

5. Melhorando a eficiência da eluição

O pH do tampão de eluição afeta significativamente a eficiência da eluição do DNA. O pH do tampão de eluição deve ser mantido entre 7.0 e 8.5 para garantir que o DNA seja totalmente eluído. Um pH muito baixo reduzirá a eficiência da eluição.

Resumindo, o ajuste do pH é crucial no processo de extração de DNA. Não só ajuda a manter a estabilidade do DNA e a prevenir a degradação, mas também otimiza a eficiência da extração, protege a atividade de enzimas relevantes, e otimiza as condições de eluição.

Fornecedor

Xangai Lingjun Biotecnologia Co., Ltda.foi estabelecido em 2016 que é um fabricante profissional de materiais biomagnéticos e reagentes de extração de ácido nucleico.

Temos vasta experiência em extração e purificação de ácidos nucleicos, purificação de proteínas, separação celular, quimioluminescência, e outras áreas técnicas.

Nossos produtos são amplamente utilizados em muitos campos, como exames médicos, testes genéticos, pesquisa universitária, melhoramento genético, e assim por diante. Nós não apenas fornecemos produtos, mas também podemos realizar OEM, ODM, e outras necessidades. Se você tiver uma necessidade relacionada, não hesite em contactar-nos emsales01@lingjunbio.com.