Pourquoi un ajustement du pH est-il nécessaire dans l'extraction d'ADN?

Le pH est très important dans l’extraction d’ADN et les raisons sont les suivantes:

1. Maintenir la stabilité de l'ADN

L'ADN reste relativement stable dans les solutions dont le pH est supérieur à 5 et moins que 9. Lorsque le pH est trop élevé (par ex., au-dessus de 12) ou faible (par ex., ci-dessous 3), les liaisons hydrogène entre les doubles brins d’ADN vont se dissocier, conduisant à la dénaturation de l'ADN. Par exemple, Le tampon II contient 0.2 M NaOH dans l'extraction d'ADN plasmidique, résultant en un pH du système de 12. 6, qui induit la dénaturation de l'ADN chromosomique et plasmidique. Par conséquent, il est nécessaire de ramener le pH à la neutralité dans les étapes suivantes. Cela sert à deux fins: d'abord, il permet à l'ADN plasmidique dénaturé de se renaturer et de rester stable; deuxième, il exploite la différence de taille des fragments entre l'ADN génomique et l'ADN plasmidique (les plasmides étant plus petits et plus susceptibles de se réhybrider en ADNdb, tandis que l'ADNg, être trop long, ne peut pas se recuire complètement et s'emmêle à la place, précipitation avec des complexes SDS-protéine sous l'influence de concentrations élevées de sel dans le tampon III).

2. Prévenir la dégradation de l'ADN

 L'EDTA peut se lier aux ions métalliques tels que Mg²⁺ et Ca²⁺ présents dans la solution. Ces ions métalliques sont des cofacteurs de la DNase. L'EDTA inhibe l'activité de la DNase, empêchant ainsi la dégradation de l'ADN en chélatant ces ions métalliques.

3. Optimiser l’efficacité de l’extraction

Des recherches ont montré que le pH optimal pour l’extraction de l’ADN est de 7,4. Le rendement de l'extraction de l'ADN est maximisé avec un tampon de pH 7. 4. Plus le pH s'écarte de cette valeur, plus le rendement d’extraction de l’ADN est faible. Par exemple, le rendement d'extraction de l'ADN à pH 7.4 est 1.09, 1.03, 1.06, et 1.11 fois qu'à pH 7,2, 7.6, 7.8, et 8.0, respectivement.

Faciliter la liaison des acides nucléiques aux billes magnétiques: Un pH approprié peut favoriser la liaison des acides nucléiques aux billes magnétiques dans les méthodes d'extraction d'ADN à base de billes magnétiques. Un tampon de liaison à haute teneur en sel peut neutraliser les charges négatives des acides nucléiques, réduire la répulsion électrostatique entre les acides nucléiques et les billes magnétiques, facilitant ainsi l'adsorption des acides nucléiques sur la surface des billes.

4. Protéger l'activité du lysozyme

Le lysozyme est utilisé lors de l'extraction de l'ADN plasmidique de bactéries Gram-positives. Le lysozyme est une glycoside hydrolase capable d'hydrolyser le β-1, 4 liaisons glycosidiques dans le peptidoglycane, le principal composant chimique de la paroi cellulaire de G⁺ bactéries, exerçant ainsi un effet lytique. L'activité du lysozyme est inhibée lorsque le pH du tampon est inférieur à 8. Donc, il est essentiel de maintenir un pH approprié pour assurer l'activité du lysozyme.

5. Améliorer l'efficacité de l'élution

Le pH du tampon d'élution affecte de manière significative l'efficacité de l'élution de l'ADN. Le pH du tampon d'élution doit être maintenu entre 7.0 et 8.5 pour garantir que l'ADN est complètement élué. Un pH trop bas réduira l’efficacité de l’élution.

En résumé, l'ajustement du pH est crucial dans le processus d'extraction de l'ADN. Cela aide non seulement à maintenir la stabilité de l’ADN et à prévenir la dégradation, mais optimise également l’efficacité de l’extraction., protège l’activité des enzymes concernées, et optimise les conditions d'élution.

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