डीएनए निष्कर्षण में पीएच समायोजन क्यों आवश्यक है??

डीएनए निष्कर्षण में पीएच बहुत महत्वपूर्ण है और इसके कारण इस प्रकार हैं:

1. डीएनए स्थिरता बनाए रखना

इससे अधिक पीएच वाले घोल में डीएनए अपेक्षाकृत स्थिर रहता है 5 और उससे भी कम 9. जब पीएच अत्यधिक उच्च हो (जैसे, ऊपर 12) या कम (जैसे, नीचे 3), डीएनए डबल स्ट्रैंड के बीच हाइड्रोजन बंधन अलग हो जाएंगे, डीएनए विकृतीकरण की ओर अग्रसर. उदाहरण के लिए, बफ़र II में शामिल है 0.2 प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण में एम NaOH, जिसके परिणामस्वरूप सिस्टम का pH मान प्राप्त होता है 12. 6, जो क्रोमोसोमल और प्लास्मिड डीएनए दोनों के विकृतीकरण को प्रेरित करता है. फलस्वरूप, बाद के चरणों में पीएच को वापस तटस्थता पर समायोजित करना आवश्यक है. इससे दो उद्देश्य पूरे होते हैं: पहला, यह विकृत प्लास्मिड डीएनए को पुन: स्वरूपित करने और स्थिर रहने की अनुमति देता है; दूसरा, यह जीनोमिक डीएनए और प्लास्मिड डीएनए के बीच टुकड़े के आकार में अंतर का लाभ उठाता है (प्लास्मिड छोटे होते हैं और डीएसडीएनए में पुनः प्रवेश करने की अधिक संभावना होती है, जबकि जीडीएनए, बहुत लंबा होना, पूरी तरह से पुनः स्थापित नहीं हो पाता और इसके बजाय उलझ जाता है, बफर III में उच्च नमक सांद्रता के प्रभाव में एसडीएस-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के साथ अवक्षेपण).

2. डीएनए क्षरण को रोकना

 EDTA घोल में मौजूद Mg²⁺और Ca²⁺ जैसे धातु आयनों से बंध सकता है. ये धातु आयन DNase के लिए सहकारक हैं. EDTA DNase की गतिविधि को रोकता है, जिससे इन धातु आयनों को केलेट करके डीएनए के क्षरण को रोका जा सके.

3. निष्कर्षण दक्षता का अनुकूलन

शोध से पता चला है कि डीएनए निष्कर्षण के लिए इष्टतम पीएच 7.4 है। पीएच 7 के साथ बफर करने पर डीएनए निष्कर्षण उपज अधिकतम हो जाती है. 4. पीएच इस मान से उतना ही अधिक विचलित होता है, डीएनए निष्कर्षण उपज उतनी ही कम होगी. उदाहरण के लिए, पीएच पर डीएनए निष्कर्षण उपज 7.4 है 1.09, 1.03, 1.06, और 1.11 पीएच 7.2 पर उससे कई गुना अधिक, 7.6, 7.8, और 8.0, क्रमश:.

चुंबकीय मोतियों से न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग की सुविधा: एक उपयुक्त pH चुंबकीय मनका-आधारित डीएनए निष्कर्षण विधियों में न्यूक्लिक एसिड को चुंबकीय मोतियों से जोड़ने को बढ़ावा दे सकता है. एक उच्च-नमक बाइंडिंग बफर न्यूक्लिक एसिड के नकारात्मक चार्ज को बेअसर कर सकता है, न्यूक्लिक एसिड और चुंबकीय मोतियों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण को कम करना, जिससे मोतियों की सतह पर न्यूक्लिक एसिड के सोखने की सुविधा मिलती है.

4. लाइसोजाइम गतिविधि की रक्षा करना

लाइसोजाइम का उपयोग ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया से प्लास्मिड डीएनए के निष्कर्षण के दौरान किया जाता है. लाइसोजाइम एक ग्लाइकोसाइड हाइड्रॉलेज़ है जो β-1 को हाइड्रोलाइज़ कर सकता है, 4 पेप्टिडोग्लाइकेन में ग्लाइकोसिडिक बंधन, जी की कोशिका भित्ति का मुख्य रासायनिक घटक⁺ जीवाणु, जिससे लाइटिक प्रभाव पड़ता है. बफर का pH इससे कम होने पर लाइसोजाइम की गतिविधि बाधित हो जाती है 8. इसलिए, लाइसोजाइम की गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए उचित पीएच बनाए रखना आवश्यक है.

5. निक्षालन दक्षता में सुधार

रेफरेंस बफर का पीएच डीएनए रेफरेंस की दक्षता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है. के बीच एल्युशन बफर का पीएच बनाए रखा जाना चाहिए 7.0 और 8.5 यह सुनिश्चित करने के लिए कि डीएनए पूरी तरह से शुद्ध है. बहुत कम पीएच, निक्षालन दक्षता को कम कर देगा.

सारांश, डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया में पीएच का समायोजन महत्वपूर्ण है. यह न केवल डीएनए की स्थिरता बनाए रखने और क्षरण को रोकने में मदद करता है बल्कि निष्कर्षण दक्षता को भी अनुकूलित करता है, प्रासंगिक एंजाइमों की गतिविधि की रक्षा करता है, और निस्पंदन स्थितियों को अनुकूलित करता है.

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