Hvorfor er pH-justering nødvendig i DNA-ekstraktion?

pH er meget vigtig i DNA-ekstraktion, og årsagerne er som følger:

1. Opretholdelse af DNA-stabilitet

DNA forbliver relativt stabilt i opløsninger med en pH større end 5 og mindre end 9. Når pH-værdien er for høj (f.eks., over 12) eller lav (f.eks., under 3), hydrogenbindingerne mellem DNA-dobbeltstrengene vil dissociere, fører til DNA-denaturering. For eksempel, Buffer II indeholder 0.2 M NaOH i plasmid-DNA-ekstraktion, hvilket resulterer i en system-pH på 12. 6, som inducerer denaturering af både kromosomalt og plasmid-DNA. Følgelig, det er nødvendigt at justere pH tilbage til neutralitet i de efterfølgende trin. Dette tjener to formål: først, det tillader det denaturerede plasmid-DNA at renaturere og forblive stabilt; anden, det udnytter forskellen i fragmentstørrelse mellem genomisk DNA og plasmid-DNA (med plasmider, der er mindre og mere tilbøjelige til at genanneal til dsDNA, mens gDNA, er for lang, kan ikke gengløde helt og bliver i stedet viklet ind, udfældning med SDS-proteinkomplekser under påvirkning af høje saltkoncentrationer i buffer III).

2. Forebyggelse af DNA-nedbrydning

 EDTA kan binde til metalioner såsom Mg²⁺ og Ca²⁺, der er til stede i opløsningen. Disse metalioner er cofaktorer for DNase. EDTA hæmmer aktiviteten af ​​DNase, derved forhindres nedbrydning af DNA ved at chelatere disse metalioner.

3. Optimering af ekstraktionseffektivitet

Forskning har vist, at den optimale pH for DNA-ekstraktion er 7,4. DNA-ekstraktionsudbyttet maksimeres, når buffer med pH 7. 4. Jo mere pH-værdien afviger fra denne værdi, jo lavere er DNA-ekstraktionsudbyttet. F.eks, DNA-ekstraktionsudbyttet ved pH 7.4 er 1.09, 1.03, 1.06, og 1.11 gange det ved pH 7,2, 7.6, 7.8, og 8.0, henholdsvis.

Letter nukleinsyrebinding til magnetiske perler: En passende pH kan fremme bindingen af ​​nukleinsyrer til magnetiske perler i magnetiske perle-baserede DNA-ekstraktionsmetoder. En høj-salt bindende buffer kan neutralisere de negative ladninger af nukleinsyrer, reduktion af den elektrostatiske frastødning mellem nukleinsyrer og magnetiske perler, derved letter adsorptionen af ​​nukleinsyrer på overfladen af ​​perlerne.

4. Beskyttelse af lysozymaktivitet

Lysozym bruges under ekstraktion af plasmid-DNA fra Gram-positive bakterier. Lysozym er en glycosidhydrolase, der kan hydrolysere β-1, 4 glykosidbindinger i peptidoglycan, den vigtigste kemiske komponent i cellevæggen i G⁺ bakterie, derved udøver en lytisk virkning. Lysozyms aktivitet hæmmes, når bufferens pH er mindre end 8. Derfor, det er essentielt at opretholde en passende pH for at sikre aktiviteten af ​​lysozym.

5. Forbedring af elueringseffektivitet

Elueringsbufferens pH påvirker signifikant effektiviteten af ​​DNA-eluering. pH-værdien af ​​elueringsbufferen bør opretholdes mellem 7.0 og 8.5 for at sikre, at DNA er fuldstændig elueret. En for lav pH vil reducere elueringseffektiviteten.

Sammenfattende, justeringen af ​​pH er afgørende i DNA-ekstraktionsprocessen. Det hjælper ikke kun med at opretholde stabiliteten af ​​DNA og forhindre nedbrydning, men optimerer også ekstraktionseffektiviteten, beskytter aktiviteten af ​​relevante enzymer, og optimerer elueringsbetingelserne.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.blev etableret i 2016 som er en professionel producent af biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraktionsreagenser.

Vi har stor erfaring med udvinding og oprensning af nukleinsyre, proteinoprensning, celleadskillelse, kemiluminescens, og andre tekniske områder.

Vores produkter er meget udbredt inden for mange områder, såsom medicinsk test, genetisk testning, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke kun produkter, men kan også påtage os OEM, ODM, og andre behov. Hvis du har et relateret behov, er du velkommen til at kontakte os påsales01@lingjunbio.com.