Hvorfor er pH-justering nødvendig i DNA-ekstraksjon?

pH er veldig viktig i DNA-ekstraksjon og årsakene er som følger:

1. Opprettholde DNA-stabilitet

DNA forblir relativt stabilt i løsninger med en pH høyere enn 5 og mindre enn 9. Når pH er for høy (f.eks., over 12) eller lav (f.eks., under 3), hydrogenbindingene mellom DNA-dobbeltrådene vil dissosiere, fører til DNA-denaturering. For eksempel, Buffer II inneholder 0.2 M NaOH i plasmid-DNA-ekstraksjon, resulterer i en system-pH på 12. 6, som induserer denaturering av både kromosomalt og plasmid-DNA. Følgelig, det er nødvendig å justere pH tilbake til nøytralitet i påfølgende trinn. Dette tjener to formål: først, det lar det denaturerte plasmid-DNA-et renaturere og forbli stabilt; sekund, det utnytter forskjellen i fragmentstørrelse mellom genomisk DNA og plasmid-DNA (med plasmider som er mindre og mer sannsynlig å reanneal til dsDNA, mens gDNA, være for lang, kan ikke gjengløde helt og blir i stedet viklet inn, utfelling med SDS-proteinkomplekser under påvirkning av høye saltkonsentrasjoner i buffer III).

2. Forebygging av DNA-nedbrytning

 EDTA kan binde seg til metallioner som Mg²⁺ og Ca²⁺ som er tilstede i løsningen. Disse metallionene er kofaktorer for DNase. EDTA hemmer aktiviteten til DNase, og forhindrer derved nedbrytning av DNA ved å chelatere disse metallionene.

3. Optimalisering av ekstraksjonseffektivitet

Forskning har vist at den optimale pH for DNA-ekstraksjon er 7,4. DNA-ekstraksjonsutbytte maksimeres når buffer med pH 7. 4. Jo mer pH avviker fra denne verdien, jo lavere DNA-ekstraksjonsutbytte. For eksempel, DNA-ekstraksjonsutbyttet ved pH 7.4 er 1.09, 1.03, 1.06, og 1.11 ganger det ved pH 7,2, 7.6, 7.8, og 8.0, hhv.

Forenkler nukleinsyrebinding til magnetiske perler: En passende pH kan fremme bindingen av nukleinsyrer til magnetiske perler i magnetiske perlebaserte DNA-ekstraksjonsmetoder. En buffer med høy saltbinding kan nøytralisere de negative ladningene til nukleinsyrer, redusere den elektrostatiske frastøtingen mellom nukleinsyrer og magnetiske perler, for derved å lette adsorpsjonen av nukleinsyrer på overflaten av kulene.

4. Beskyttelse av lysozymaktivitet

Lysozym brukes under ekstraksjon av plasmid-DNA fra Gram-positive bakterier. Lysozym er en glykosidhydrolase som kan hydrolysere β-1, 4 glykosidbindinger i peptidoglykan, den viktigste kjemiske komponenten i celleveggen til G⁺ bakterie, og utøver derved en lytisk effekt. Aktiviteten til lysozym hemmes når pH i bufferen er mindre enn 8. Derfor, det er viktig å opprettholde en passende pH for å sikre aktiviteten til lysozym.

5. Forbedring av elueringseffektivitet

pH i elueringsbufferen påvirker i betydelig grad effektiviteten til DNA-eluering. pH i elueringsbufferen bør opprettholdes mellom 7.0 og 8.5 for å sikre at DNA blir fullstendig eluert. En pH som er for lav vil redusere elueringseffektiviteten.

Oppsummert, justeringen av pH er avgjørende i DNA-ekstraksjonsprosessen. Det bidrar ikke bare til å opprettholde stabiliteten til DNA og forhindre nedbrytning, men optimaliserer også ekstraksjonseffektiviteten, beskytter aktiviteten til relevante enzymer, og optimerer elueringsforholdene.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.ble etablert i 2016 som er en profesjonell produsent av biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraksjonsreagenser.

Vi har rik erfaring innen utvinning og rensing av nukleinsyre, proteinrensing, celleseparasjon, kjemiluminescens, og andre tekniske felt.

Våre produkter er mye brukt på mange felt, som medisinsk testing, genetisk testing, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke bare produkter, men kan også påta oss OEM, ODM, og andre behov. Hvis du har et relatert behov, ta gjerne kontakt med oss ​​påsales01@lingjunbio.com.