Desmistificando a eletroforese em gel de agarose com ácido nucleico

Em experimentos de biologia molecular, verificando a qualidade ácidos nucleicos extraídos pelo método de esfera magnética através de eletroforese em gel de agarose (corrida de gel) é um passo crucial. No entanto, iniciantes geralmente encontram alguns fenômenos confusos de eletroforese. Que informações estão por trás desses fenômenos anormais? Então como isso pode ser evitado?

1. Acompanhamento de banda: Um aviso sobre a degradação do ácido nucleico

Quando a banda mostra uma cauda contínua semelhante a uma mancha de cima para baixo, geralmente indica que o ácido nucleico se degradou. Isto pode ser porque:

1. Degradação da própria amostra (falha em manuseá-lo imediatamente após a coleta ou congelamento e descongelamento repetidos

2. A contaminação por nuclease é introduzida durante o processo de operação

3. O tempo de armazenamento após rachaduras é muito longo

4. Força de cisalhamento mecânico excessiva (sopro e golpes excessivamente vigorosos)

Medidas preventivas: Use amostras frescas; Garantir que o ambiente experimental esteja limpo e livre de poluição; O processo de operação é suave. Após a extração ser concluída, teste-o imediatamente ou armazene-o a -80 ℃.

2. Desfoque de banda: Um sinal indicando impurezas residuais

Se a difusão da banda estiver borrada e o limite não estiver claro, o motivo mais comum é:

1. Íons de sal residuais (lavagem incompleta

2. Contaminação por proteínas ou polissacarídeos

3. Resíduo de etanol (afetando a mobilidade eletroforética

Medidas preventivas: Certifique-se de que todo o líquido residual seja completamente aspirado após a última lavagem. Deixe as esferas magnéticas secarem moderadamente (a superfície deve estar opaca, mas não rachada); Para amostras complexas, o número de lavagens pode ser aumentado.

3. Bandas sorridentes: Condições inadequadas de eletroforese

As duas extremidades da banda se curvam para cima em uma “sorriso” forma, que geralmente está relacionado às condições de eletroforese:

1. Intensidade excessiva do campo elétrico (tensão muito alta)

2. Resfriamento irregular do gel

3. A força iônica do tampão de eletroforese é inadequada ou foi reutilizada muitas vezes

Medidas preventivas: Reduza adequadamente a voltagem da eletroforese; Use tampão de eletroforese recém-preparado; Certifique-se de que o tanque de eletroforese esteja equipado com um dispositivo de resfriamento apropriado.

4. Outras perguntas frequentes

Sem banda: Pode ser devido à perda do cordão magnético, eluição insuficiente ou tamanho de amostra insuficiente

Pontos brilhantes anormais: Pode ser contaminação por RNA (em amostras de DNA) ou contaminação de DNA genômico (em amostras de RNA)

Aconselhamento profissional: Controles positivos e negativos devem ser configurados para cada experimento. Isso ajuda a determinar rapidamente se o problema está na própria amostra ou no processo de extração. Ao mesmo tempo, lembre-se de que a aplicação da cola é apenas o primeiro passo na inspeção de qualidade. Para experimentos downstream, como qPCR e sequenciamento, é recomendado usar Nanodrop ou Qubit para quantificação precisa.

Compreender as causas e soluções desses problemas comuns pode não apenas ajudá-lo a obter belos resultados de eletroforese, mas também ser a chave para garantir o sucesso dos experimentos posteriores. Bons hábitos experimentais e operações técnicas meticulosas são a base para a obtenção de amostras de ácidos nucleicos de alta qualidade.

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